[发明专利]一种外泌体中肺癌标志物GK5快速检测试剂盒

说明书

一种外泌体中肺癌标志物GK5快速检测试剂盒，属于试剂盒技术领域。该试剂盒含有外泌体原位捕获孔板，所述的外泌体原位捕获孔板中每孔含有荧光素标记的分子信标，所述的分子信标为靶向肿瘤标志物GK5 mRNA的特异性DNA探针。本发明的试剂盒运用了外泌体原位捕获孔板技术，检测肺癌患者体液样品中外泌体所包含的，肿瘤标志物GK5 mRNA，可用于医学临床肺部肿瘤的早期诊断。该技术是基于外泌体检测的第三代液体活检技术，具有无创或微创、超高灵敏度、快速且特异等优点，适用于医学临床肺部肿瘤的分子诊断和流行病学调查。

技术领域

本发明属于试剂盒技术领域，具体涉及一种外泌体中肺癌标志物GK5快速检测试剂盒。

背景技术

液体活检可通过无创或微创的取样方式获得疾病信息，是“精准医疗”代表性的诊断技术，其检测对象主要为外周血中的循环肿瘤细胞(CTC)、循环游离DNA(cfDNA)和外泌体(exosome)。本质上，液体活检是分子诊断在样本来源上的延伸，是分子诊断市场容量的扩容，是实现为患者做出更好诊断服务的切入点。外泌体因其含量丰富，内含物来源特异、稳定等特性，逐渐成为液体活检领域的新宠，成为分子诊断学应用的重要开发方向。

外泌体(exosome)，是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，直径大约30‐150nm，具有脂质双层膜结构，能很好地保护其包被的物质。这种微小膜泡中含有宿主细胞来源的特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞，是细胞之间通讯的重要媒介，可使受体细胞发生多种生物功能的改变。据报道，这种外逸性介导的细胞间通讯影响了癌症的几个特征，包括调节免疫反应、重编程基质细胞、重建细胞外基质结构，甚至赋予癌细胞耐药特性。不同细胞分泌的外泌体组份和含量不同，选择性地将特定的致癌分子装入外泌体中，通过在肿瘤和远端微环境的不同细胞之间转移生物活性分子参与癌症进展和转移，使外泌体成为潜在的诊断生物标志物和治疗靶点。此外，在临床前和临床试验中基于外源体的药物传递策略已经被证明可以显著地抑制癌症的发展。

外泌体原位捕获孔板技术是一种全新的外泌体原位捕捉与检测技术，尤以检测外泌体中的mRNA和microRNA见长。其以镀金生物膜玻璃为载体，涂附上一层包裹有特异识别疾病相关microRNA或mRNA靶标的分子信标(自行设计)的阳离子脂质纳米颗粒，其与外泌体融合后，分子信标与靶标结合而产生荧光信号，被全内反射荧光显微镜(TIRF)检测，信号强弱和相应靶标含量成正比，从而判断病程或锁定病原体。由于TIRF成像具有超微，对荧光信号超敏感的特性，使得外泌体捕获孔板结合TIRF成像技术，可以实现对外泌体这种纳米级囊泡的直接成像及其内含物的半定量检测。外泌体捕获孔板可制作成24、48、96、384孔多种规格，每孔可包被单一或3种荧光素标记的分子信标，将多个肿瘤标志物基因检测通道集成在一张芯片上，以利于临床高通量筛选，省时省力省成本，这对于临床中常见的肿瘤相关基因快速诊断来说，无疑是个巨大的优势。

肺部肿瘤即生长在肺部的肿瘤，主要分为良性肿瘤和恶性肿瘤，肺癌是起源于上皮细胞的恶性肿瘤。近年，肺癌的发病率呈迅速上升趋势，已成为人类肿瘤致死首位病因。肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两类，小细胞肺癌约占肺癌的20％，恶性程度高，倍增时间短，转移早而广泛，对化疗、放疗敏感，初治缓解率高，但极易发生继发性耐药，容易复发。非小细胞肺癌则占肺癌总数的80％，是最为常见的肺癌。它主要包括腺癌、鳞状细胞癌即肺鳞癌、大细胞未分化癌三类，其对于传统放化疗敏感性较差。肺癌的早期诊断具有重要意义，只有在病变早期得到诊断、早期治疗，才能获得较好的疗效。肺癌的早期诊断可以通过拍摄胸部X线片来了解肺内的异常情况。此外还可进行血液常规检查以及痰液找病理细胞等相关化验帮助诊断，并进行一系列深入的检查，包括支气管镜、纵隔镜、肺组织活检以及胸腔镜等。然而，这些方法特异性和灵敏度均较低，倘若能在患者的体液样品中检测到肿瘤细胞来源的特异性核酸，那么对于肺癌的早期诊断将起到积极作用。由于外泌体在各种体液样品中大量存在，且其中富含肿瘤细胞来源的特异性核酸，因此可以通过分离外泌体，运用高度灵敏的外泌体捕获孔板检测技术加以鉴定。

发明内容