[发明专利]新型HIV-1耐药检测方法的建立及其应用

说明书

本发明公开了一种新型HIV‑1耐药检测方法的建立及其应用。本发明建立的新型HIV‑1耐药检测方法，优点在于：①利用多套引物组合，兼顾了不同亚型毒株序列差异所造成的目的基因扩增效率低下的问题；②在一个反应管中完成了PR、RT和IN靶标基因cDNA的合成与目的基因巢式PCR的第一轮扩增，避免了分别对目的基因进行扩增，简化了实验流程，将试剂成本节约一半。本发明建立的检测方法，可同时覆盖多个毒株亚型、同时涵盖多个基因区域，使得HIV‑1耐药检测效率大大提高，对于艾滋病防治和公共卫生具有重大影响。

技术领域

本发明涉及一种新型HIV-1耐药检测方法的建立及其应用。

背景技术

自1981年艾滋病发现以来，导致该疾病发生的元凶HIV(Human immunodeficiencyvirus,HIV)在全球迅速蔓延，先后致3,700万人感染，从而引发严重的公共卫生问题。为有效控制这一疾病的快速进展与蔓延,抗病毒治疗(Antiretroviral therapy,ART)作为控制个体病程的措施，同时也作为管理传染源的手段用于HIV感染的预防应运而生,目前已有2,009万感染者接受了ART。从13个亚洲国家/地区治疗效果来看，ART对免疫重建起到了重要的作用，CD4细胞可从低点的115个/μL回升至302个/μL，病毒抑制率在某些地区可达到80％左右。中国目前报告存活的HIV/AIDS将近76万人(内部交流资料：2017年全国艾滋病/丙肝防治进展),全人群感染率为0.055％。为实现WHO提出的3个90％的防治目标，中国也在快速扩大治疗，已将近49万感染者接受了免费ART。免费ART在延长艾滋病患者生命(存活比例由2004的22％上升到2013年的54％)、提高生活质量和减少艾滋病的传播(单阳新发感染率从2011年的2.61％下降到2016年的0.68％)等方面均取得了长足进展(内部交流资料：2017年全国艾滋病/丙肝防治进展)。截至2017年，中国目前在治成人/儿童患者接近61万人。

耐药性的出现是导致ART失败的主要原因之一，其产生是病毒、药物和宿主共同作用的结果。在药物选择压力下，HIV-1耐药毒株被筛选出来并逐渐发展成为优势毒株，从而表现为药物敏感性降低和/或病毒学反应不理想，即发生了耐药，影响了ART效果。耐药导致ART失败的报道层出不穷，如在某些开展ART地区进行的HIV-1耐药监测显示，约有50％患者经历免疫学失败，继而HIV-1耐药性毒株出现并快速流行；某些地区，针对一线药物的耐药性毒株的流行率已远超50％，并且新诊断人群传播性耐药亦呈快速上升趋势。HIV-1耐药毒株的传播与流行为艾滋病的防控也带来了前所未有的困难。

相对于药物敏感性检测的金标准表型实验，基因型耐药检测具有检测周期短、成本低廉、简便易行便于推广等优点，因此在发展中国家具有很大的应用市场。当前HIV-1基因型耐药检测方法主要是针对药物靶标进行的，如已获美国FDA批准的2种HIV-1基因型耐药检测试剂ViroSeq^TM与TRUGENE，检测区域为蛋白酶(Protease,PR)全长和逆转录酶(Reverse transcriptase,RT)部分区域，这些区域涵盖了所有(Protease Inhibitors,PIs)PIs与(Reverse transcriptase Inhibitors,RTIs)RTIs的作用靶点，通过检测这些区域的基因突变及突变间的相互作用可间接评估出体内病毒对药物的耐受水平。另外不同实验室根据实验目的不同，也建立起实验室内部使用的基因型耐药检测方法，检测区域也无一例外是针对药物作用靶标的。