[发明专利]一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法

说明书

本发明涉及疫苗领域，公开了一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，包括：A）病毒的裂解和预分离；B）SDS‑PAGE分离与LC‑MS鉴定具体的病毒亚组分蛋白；C）电洗脱法分离病毒亚组分蛋白；D）稳定表达B5R，D8L和K2L的293T细胞系的构建以及TLR2配体活力的测定。本发明建立了一整套筛选和鉴定具有TLR2配体活力的牛痘病毒蛋白亚组分的方法，并鉴定出病毒蛋白D8L具有TLR2配体活力，并且可用于制备抗病毒感染和抗肿瘤的TLR类疫苗佐剂。

技术领域

本发明涉及疫苗领域，一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法。

背景技术

宿主响应病毒感染的免疫应答机制，主要通过模式识别受体（PRRs）来识别不同病毒中的相关配体，这些配体称为病原相关分子模式（PAMPs），包括病毒蛋白，DNA，RNA等。与病毒的DNA和RNA不同，病毒蛋白主要被TLR家族蛋白所识别，包括TLR2和TLR4。先天免疫细胞，例如巨噬细胞和DCs，均表达TLR2和TLR4，因此能被相关病毒激活，并且分泌多种炎症因子，导致宿主免疫反应的激活。我们的研究结果表明牛痘病毒（VV）可以激活DC细胞（DCs）或巨噬细胞内的TLR2-MyD88信号通路，引起细胞前炎症因子的分泌增加以及T细胞反应的增强。但是，TLR2具体被病毒颗粒中的何种分子激活仍不清楚。

疫苗在传染病的预防与控制过程中发挥着重要作用。例如，牛痘病毒疫苗用于天花病毒的预防，使天花病毒自上世纪70年代之后几乎绝迹。传统的牛痘病毒疫苗主要是采用活体的牛痘病毒制备而成，常伴有较高频率的毒副作用，尤其对于患有湿疹和免疫缺陷的病人，甚至可能具有潜在危害。相比之下，一种更安全的替代方法是使用高度纯化的重组蛋白疫苗。随着新型重组蛋白疫苗的发展，蛋白疫苗也广泛用于其他恶性疾病的治疗，如肿瘤的治疗过程中。其原理是将肿瘤抗原以肿瘤相关蛋白或多肽的形式导入患者体内，克服肿瘤引起的免疫抑制状态，增强免疫原性，激活患者自身的免疫系统，诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的目的。目前研究的大多数疫苗是基于高度纯化的重组蛋白或者病原亚基。但是，许多重组蛋白激活保护性免疫反应的能力较弱，因此蛋白疫苗需要与佐剂共同使用来增强抗原的免疫原性。佐剂是一种非特异性的免疫增强剂。一般认为，佐剂的种类直接决定了免疫的效果和免疫反应的类型，但是其中的作用机制仍不清楚。改良疫苗和佐剂的组分以提升免疫效果是当务之急。以牛痘病毒为例，牛痘病毒颗粒中共含有约30种蛋白组分，相关研究鉴定出多种病毒表面抗原基因在宿主免疫应答中发挥功能，但是这些抗原蛋白通过何种机制激活宿主免疫应答，以及是否需要疫苗佐剂来实现免疫保护并不清楚。因此，需要以某些特定指标为基准建立一整套分析和鉴定牛痘病毒中具有疫苗佐剂活性的蛋白亚组分的技术方法，并以此为基础开发更安全高效的适用于抗病毒和抗肿瘤的疫苗佐剂。。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明建立了一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，具体地，本发明建立了一整套筛选和鉴定具有TLR2配体活力的牛痘病毒蛋白亚组分的技术方法，并鉴定出病毒蛋白D8L和K2L具有TLR2配体活力。其中D8L的TLR2配体活力较强，并且单独用重组蛋白D8L免疫小鼠，可以使小鼠体内的免疫应答增强和产生保护性抗体。因此鉴定出的病毒重组蛋白D8L既是一类TLR类疫苗佐剂，同时也是一种具有免疫原性的病毒抗原，可用于制备抗天花病毒感染的蛋白疫苗。 由于TLR2通过识别多种病原相关分子模式，引起机体的先天免疫或体液免疫，该技术也适用于针对其他病毒或病原的TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定。此外，肿瘤细胞携带的肿瘤相关抗原也能被TLR类受体识别，因此TLR类疫苗佐剂也可用于激发人体对肿瘤细胞的免疫能力，起到抗肿瘤的作用。

本发明的具体技术方案为：一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，包括以下步骤：

A）病毒的裂解和预分离；

B）SDS-PAGE分离与LC-MS鉴定具体的病毒亚组分蛋白；

C）电洗脱法分离病毒亚组分蛋白，用于TLR2配体活力测定；