[发明专利]一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法

权利要求书

1.一种牛痘疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

A）病毒的裂解和预分离：

1）用温和的去垢剂Triton X-100裂解牛痘病毒，得到病毒裂解液；

2）用带有分子筛的透析卡透析去除病毒裂解液中的去垢剂成分；

3）对病毒裂解液离心处理，去除不溶性沉淀，并测定上清液中的蛋白浓度；

4）用分子筛将蛋白分成30kD，30-100kD和100kD三种病毒亚组分蛋白；

5）分别测定每种病毒亚组分蛋白的蛋白浓度，取部分各病毒亚组分蛋白，用于TLR2配体活力测定；

6）根据步骤D）中的方法测定每种病毒亚组分蛋白的TLR2配体活力，筛选具有TLR2配体活力的病毒亚组分蛋白用于后续的分离和鉴定步骤；B）SDS-PAGE分离与LC-MS鉴定具体的病毒亚组分蛋白；

C）电洗脱法分离病毒亚组分蛋白，用于TLR2配体活力测定；

D）稳定表达病毒重组蛋白的293T细胞系的构建以及TLR2配体活力的测定。

2.如权利要求1所述的一种牛痘疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，其特征在于，所述病毒重组蛋白为B5R、D8L或K2L。

3.如权利要求1所述的一种牛痘疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，其特征在于，步骤A）的步骤3）中，离心条件为13000-17000g，20-40min。

4.如权利要求1所述的一种牛痘疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，其特征在于，步骤B）具体为：

1）将100 ~200μg步骤A）中分离得到的病毒亚组分蛋白，用非还原和非变性的SDS-PAGE分离；

2）考马斯亮蓝法染色，区分不同分子量的蛋白条带；

3）拍照并切下每个条带，取部分胶块，用胶内酶解法将胶内的蛋白质消化成多肽片段，接着用LC-MS鉴定每个条带的多肽序列和蛋白质种类；

4）剩余胶块用于电洗脱法分离病毒亚组分蛋白。

5.如权利要求4所述的一种牛痘疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，其特征在于，步骤C）具体为：

1）用电洗脱仪对步骤B）中剩余胶块进行电洗脱，电洗脱条件为：55-65V恒压1-5℃过夜；

2）根据分子量选择30kD的分子筛透析，去除30kD以下的病毒亚组分蛋白和电泳缓冲液中的缓冲盐成分；

3）将病毒亚组分蛋白用10kD分子筛浓缩成80-120μL，测定浓度后，可用于TLR2配体活力的测定。

6.如权利要求5所述的一种牛痘疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，其特征在于，步骤D）具体为：

1）在体外培养和扩增稳定表达人TLR2或TLR4的HEK293细胞：HEK293，HEK293-hTLR2/CD14，HEK293-hTLR4/CD14和HEK293-hCD14；HEK293和HEK293-hCD14作为不表达TLR2或TLR4的阴性对照；

2）将步骤A）中和C）中分离得到的病毒亚组分蛋白稀释成不同浓度，分别刺激以上各种细胞；

3）刺激15-20h后，用ELISA试剂盒检测上清中人IL-8的分泌，培养基中的TLR配体与HEK293细胞中的TLR2或TLR4结合后，会激活NF-κB信号通路和引起人IL-8的表达和分泌增加，因此通过检测上清中人IL-8的含量能反映TLR2的激活情况；

4）根据步骤B）中鉴定出的病毒亚组分蛋白，构建含有上述病毒亚组分蛋白ORF的表达质粒，用于转染293T细胞，获得稳定表达该病毒重组蛋白的293T转基因细胞；

5）将所获293T转基因细胞与HEK293，HEK293-hTLR2/CD14，HEK293-hTLR4/CD14和HEK293-hCD14按照不同的浓度分别共培养；培养15-20h后收集上清，按照步骤3）方法测定上清中人IL-8的含量，用于验证细胞内表达的某种病毒蛋白是否具有TLR2配体活力。