[发明专利]一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法

说明书

本申请属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法。该方法包括菌种活化、种子培养、发酵制备碱性蛋白酶等步骤。其中发酵制备碱性蛋白酶所采用的发酵培养基中含有：玉米淀粉或可溶性淀粉1.5~3.5%、棉仁蛋白粉0.5~2.5%、磷酸氢二钠0.1~0.3%、磷酸二氢钾0.1~0.2%、氯化钙0.02~0.03%。本申请中，通过对发酵工艺及发酵培养基进行优化，尤其是在发酵后期通过补充特定营养糖和氮源等营养成分，较好提高了发酵活力。测定结果表明，本申请通过工艺优化后，发酵活力可达5.8万U/mL以上，远高于现有的3.5万U/mL的发酵水平，表现出较好的提升效果。

技术领域

本申请属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法。

背景技术

碱性蛋白酶（Alkaline Protease）是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类，广泛存在于动、植物及微生物生物体中，在猪的胰脏中最早被发现。研究表明，碱性蛋白酶大都属于丝氨酸蛋白酶，酶活性中心含有丝氨酸，等电点pI值多数在8.0左右，其分子量一般在15-40 kDa。

碱性蛋白酶作为一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、皮革、洗涤剂、酿造等行业，其最大用途是作为添加剂生产加酶洗涤剂。而食品方面的应用主要用于蛋白类食品的发酵、肉类嫩化、酒精澄清等。由于用途及应用范围十分广泛，因此产业内每年对碱性蛋白酶的需求量都很大，并呈持续增长趋势，为此，如何持续提高碱性蛋白酶的发酵活力及提高碱性蛋白酶产量是业内迫切需要关注和解决的技术问题。

发明内容

本申请目的在于提供一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法，从而为碱性蛋白酶的生产、应用奠定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法，该方法具体包括如下生产步骤：

（1）菌种活化

以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）作为发酵菌株，首先将低温冰箱中保存的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）原种接种到LB平板培养基上，37℃恒温培养24小时以进行菌种复苏，然后将活化后地衣芽孢杆菌接入斜面培养基，好氧条件下35~38℃培养28~36h以进行活化菌株；

所述斜面培养基，为固态，质量百分含量计，具体组成为：蛋白胨 0.4%，牛肉膏 0.2%，磷酸二氢钾0.3%，琼脂1.6%，pH自然；

所述地衣芽孢杆菌发酵菌株具体例如采用中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏号为CICC 10266的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）菌株；

（2）种子培养

将步骤（1）中复苏、活化后菌种接入种子培养基中（质量比例计，接种量0.5~2%），35~38℃恒温、180~250r/min转速摇床培养28~37h，以此作为种子液；

所述种子培养基，为液态，以质量百分比计，培养基中含有：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、氯化钠1%、葡萄糖2%；

将种子液按1~3%的体积比例接种入含有灭菌后一级种子培养基的发酵罐中，35~38℃、210~270 r /min（优选37℃、180 r /min）发酵培养20~30h，以此作为一级种子液；

所述一级种子培养基，以质量百分含量计，培养基组成为：葡萄糖0.5%，玉米淀粉2%，棉仁蛋白粉 1.2%，磷酸二氢钾0.2%，pH自然；

发酵过程中，发酵罐压保持在0.05~0.08Mpa，发酵液与通气量比（V/V▪min）为1：0.45~0.8（优选1：0.6）；