[发明专利]一种三维肿瘤球培养基添加剂、培养基以及三维肿瘤球培养方法

说明书

本发明提供了一种三维肿瘤球培养基添加剂、培养基以及三维肿瘤球培养方法。所述添加剂由增稠剂和凝胶剂组成，增稠剂选自甲基纤维素、乙基纤维素、基底膜基质、胶原蛋白中的一种或多种的组合，凝胶剂选自结冷脚、海藻酸或琼脂糖凝胶中的一种或多种的组合。所述三维肿瘤球的培养基，包括肿瘤细胞培养基和前述的三维肿瘤球培养基添加剂。多种细胞系结果显示本发明培养基可在高密度培养中，明显降低肿瘤球聚集、融合。

技术领域

发明涉及生物领域，具体涉及一种制备肿瘤球的培养基及其肿瘤球大量三维(3D)制备的方法。

背景技术

肿瘤干细胞(Cancer stem cells)理论认为肿瘤组织中有一群具有干细胞性质的肿瘤细胞，它们才是肿瘤发生、发展、复发、转移的根本原因。肿瘤球培养是目前最为常用的培养和富集肿瘤干细胞、鉴定细胞干性能力的方法。都是在无血清和非贴壁环境(超低粘附皿)下进行培养，经一周左右培养其中部分具有“干性”特征细胞形成肿瘤球。培养方案有多种，如经典的DMEM/F12+20ng/ml EGF+20ng/ml FGF+2％B27方案。具体所添加的成分包括：表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白细胞抑制因子(LIF)、B27、胰岛素、转化生长因子-β(TGF-β)等。

现有技术所采用的传统的肿瘤球培养法容易发生聚集、粘附、成团，失去肿瘤球单细胞来源的特征，且肿瘤球培养量少，费用高，操作难度大。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供一种三维(3D)肿瘤球培养基添加剂。

本发明的第二个目的在于，提供一种三维肿瘤球培养基。

本发明的第三个目的在于，提供一种三维肿瘤球培养方法。

根据本发明的一个方面，提供一种三维肿瘤球培养基添加剂，其由增稠剂和凝胶剂组成；

发明人认为传统细胞悬浮培养基中，由于在非贴壁环境下，细胞生长中无附着点，在外界微小作用力下便会出现移动进而导致聚集、粘附、成团。由于肿瘤球容易聚集、粘附因此在实际的应用中常通过降低细胞接种数量来较少以上现象；这就导致培养的肿瘤球量比较少。而本发明意外的发现通过加入增稠剂和凝胶剂两种生物材料就能实现高密度、大量培养肿瘤球的目的。

增稠剂可增加培养基黏度从而限制肿瘤球在各方向上的运动，凝胶剂具有促凝胶作用使培养基产生一定硬度进而控制肿瘤球的沉降速度，产生3D培养的效果。

进一步地，增稠剂选自甲基纤维素(MC)、乙基纤维素、基底膜基质、胶原蛋白中的一种或多种的组合；凝胶剂选自结冷胶、海藻酸或琼脂糖凝胶中的一种或多种的组合；

再进一步地，所述增稠剂与凝胶剂的质量比例为1-100：1，优选为5-15：1，更优选为10：1；

使用添加剂时，所述增稠剂与培养基的质量体积比为0.1-0.5％，优选为0.3％；凝胶剂与培养基的质量体积比为0.01％-0.05％，优选为0.03％。

根据本发明的又一个方面，提供了一种三维肿瘤球的培养基，其包括肿瘤细胞培养基和前述的三维肿瘤球培养基添加剂，所述肿瘤细胞培养基选自本领域常用的任意细胞培养基，优选为无血清肿瘤球培养基；

进一步地，本发明的三维肿瘤球的培养基为在DMEM/F12中加入EGF、FGF、B27、0.3％的甲基纤维素(MC)和0.03％结冷脚(GG)制成；

再进一步地，本发明的三维肿瘤球的培养基为在DMEM/F12中加入20ng/ml的EG F、20ng/ml的FGF、2％的B27(将商品B27溶液按照体积1:50添加)、0.3％的甲基纤维素(MC)和0.03％结冷胶(GG)制成；

本发明所述三维肿瘤球培养基的制备方法包括如下步骤：