[发明专利]一种恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的T细胞制备与扩增方法及其应用

说明书

本发明涉及一种恶性肿瘤晚期肺转移伴恶性胸腔积液患者的肿瘤治疗方法，所述方法包括：于肺转移患者出现的癌性胸水中引流收集胸腔积液，离心富集后分离出转移性胸水中单核细胞(PEMC)，调节浓度5×10⁵/ml于24孔板各孔，置于培养箱，用辐照后健康成人的外周血单核细胞(PBMC)与IL‑2联合应用扩增PEMC，辐照后的PBMC作为滋养细胞刺激PEMC的扩增及细胞毒性试验。本发明还提供通过上述方法制备得到的PEMC在制备治疗恶性肿瘤晚期肺转移伴恶性胸腔积液的药物中的用途。其优点表现在：提供了一种效率更高、工艺相对便捷的PEMC扩增方法，扩增效率达到1000倍，并具备高强的细胞毒杀伤作用。

技术领域

本发明涉及免疫学、分子生物学和细胞生物学技术领域，具体地说，是一种恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的T细胞制备与扩增方法及其应用。

背景技术

恶性胸腔积液是指原发于胸膜或其他部位的恶性肿瘤转移至胸膜引起的胸腔积液，亦是恶性肿瘤常见且难于控制的晚期并发症，增长迅速，常伴有胸闷、气急、心悸等症状，治疗不及时可造成患者呼吸循环功能障碍、低蛋白血症、贫血，严重者甚至危及生命，影响患者的生存质量。而出现恶性胸腔积液常常表明肿瘤播散或已进展至晚期，肿瘤多已耐受放化疗、突变量大，患者生存期缩短。因此有效地控制胸腔积液、控制转移瘤及原发恶性肿瘤，延长肿瘤患者生存期、提高生存质量是目前晚期恶性肿瘤治疗的一大难题。

根据恶性胸腔积液诊治专家共识，恶性胸腔积液一经确诊，应尽早考虑姑息治疗。对患者症状、一般情况及预期生存时间全面评估后制定治疗方案，主要目的为减轻呼吸困难。较常见的方法包括临床观察、治疗性胸腔穿刺、肋间置管引流、胸膜固定术、胸腔镜手术治疗等。临床采用方法较多，但总体疗效有限，临床亟需新的治疗策略。

以往文献报道，将大剂量IL-2胸腔内注射，可使癌性胸水减少，甚至消失，局部症状缓解。理论上主要是通过IL-2激活LAK细胞产生过继性免疫效果，LAK细胞可杀伤肿瘤细胞，同时增强NK细胞活性，调节机体免疫功能，抑制肿瘤生长。虽然应用该方法治疗效果不一，且大剂量应用可能出现心肺毒性反应，患者耐受差，但却是早期通过提高人体自身免疫效应杀伤恶性肿瘤的方法。目前治疗恶性胸腔积液时，对于大量胸腔积液的患者进行胸腔穿刺闭式引流，而引流出的胸水则被作为医疗废物由专门医疗废物处理单位回收，同时这种方法为姑息性的治疗手段，多为缓解患者胸闷症状，暂时改善呼吸功能。

过继性细胞免疫治疗(AdopitveCellTherapy，ACT)是肿瘤治疗的新方法，用于癌症治疗的ACT有目前主流三种形式，分别为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR-T)细胞疗法。与传统治疗方式不同，肿瘤免疫疗法是一种针对人体免疫系统而非直接针对肿瘤的疗法，通过激发或者调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。

肿瘤浸润淋巴细胞是脱离血流后进入到肿瘤中的白细胞，当存在大量肿瘤浸润淋巴细胞时，表面机体启动了对抗肿瘤的免疫反应。肿瘤浸润淋巴细胞对黑色素瘤患者进行过继细胞治疗取得了很好的效果。与之相比恶性胸水中的单核淋巴细胞并非传统意义上的TIL，但其与TIL相似都是经转移性肿瘤抗原呈递，能够识别肿瘤变异抗原位点，靶向性强。通过体外细胞毒性实验可验证PEMC具备极高的肿瘤靶向性及杀伤能力。而PEMC较TIL具备多种优势：(1)患者多为肿瘤晚期，无法耐受手术，难以取得肿瘤组织或转移性淋巴结，而转移性胸水的收集是为缓解患者症状而进行的引流，其本身并未对患者增加任何创伤负担；(2)患者生存期短，传统方法提取及扩增TIL周期较长，而通过分步离心法即刻得到PEMC，可快速进行扩增，及时满足临床治疗需要量；(3)在突变复合转移瘤的胸水中提取的PEMC较原位肿瘤中提取的TIL可能识别更多的肿瘤特异性抗原。因此PEMC在治疗恶性肿瘤晚期肺转移伴恶性胸腔积液的患者较传统TIL具有更多的优势，同时也为晚期肿瘤患者提供了免疫治疗新方法。