[发明专利]一种恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的T细胞制备与扩增方法及其应用

权利要求书

1.一种恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的T细胞制备及扩增方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)外周血单核细胞PBMC的制备；

(2)转移性胸水中单核细胞PEMC的制备；

(3)原代肿瘤细胞的富集；

(4)目标PEMC在经辐照异体PBMC联合高剂量IL-2刺激下进行扩增。

2.根据权利要求1所述的一种恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的T细胞制备及扩增方法，其特征在于，所述PBMC是由外周血中制得；PBMC的制备方法为：

(1)抗凝管采取外周静脉血，充分摇晃；

(2)外周血与PBS等体积充分混匀；

(3)将混合液体与淋巴细胞分离液按混合液体体积：淋巴细胞分离液体积＝4:3比例置于淋巴细胞分离液上层，离心法分离后取悬浮于中间的白膜层细胞；

(4)加入等体积PBS充分混匀，离心后去上清液；

(5)无血清细胞培养基重悬，离心后去上清，重复3次，沉淀即为所述PBMC。

3.根据权利要求1所述的一种恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的T细胞制备及扩增方法，其特征在于，所述PEMC是由恶性肿瘤肺转移患者转移性胸水中制得，PEMC制备方法为：

(1)恶性胸腔积液患者行胸腔闭式引流术，将引流液置于经灭菌及肝素处理的玻璃瓶中；

(2)将恶性肿瘤肺转移患者的转移性胸腔积液通过离心法富集后，再通过淋巴细胞分离液离心分离，从而获取引流出转移性胸腔积液中的单核细胞；

(3)加入等体积PBS，离心后去上层；

(4)PBS重悬，再离心去上清液，重复3次，沉淀即为所述PEMC。

4.根据权利要求1所述的一种恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的T细胞制备及扩增方法，其特征在于，所述扩增PEMC的方法为：

(1)无血清培养基重悬PBMC，浓度调节至1×10⁶/mL置于培养瓶；

(2)辐照PBMC总剂量40Gy；

(3)将辐照后的PBMC与游离在恶性积液中的单核淋巴细胞中的PEMC联合培养，同时加入高剂量IL-2，浓度为6000U/mL；

(4)每隔半天换液并进行细胞计数，14天后离心去上层上清液，沉淀即为扩增后PEMC。

5.根据权利要求1所述的一种恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的T细胞制备及扩增方法，其特征在于，所述原代肿瘤的富集的具体方法为：

(1)恶性胸腔积液患者行胸腔闭式引流术，将引流液置于经灭菌及肝素处理的玻璃瓶中；

(2)分步离心法获取引流出转移性胸腔积液中的单核细胞；

(3)加入等体积PBS，离心后去上层；

(4)PBS重悬，再离心去上清液，重复3次；

(5)24孔板培养24-48小时后，轻轻吹起未贴壁细胞，剩余贴壁细胞换入10％FBS高糖DMEM培养基继续培养；

(6)培养24-48小时，可见形态符合原发肿瘤且快速扩增的即为原代肿瘤细胞。

6.根据权利要求1所述的一种恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的T细胞制备及扩增方法，其特征在于，所述方法还包括细胞毒性试验，细胞毒性试验的具体方法为：

(1)应用胰蛋白酶消化解离贴壁的原代肿瘤细胞，预置荧光剂，计数5×10³/孔，置于96孔板中；

(2)将制备扩增完毕的PEMC与原代肿瘤共培养，将PEMC与原代肿瘤细胞按照效靶比为20:1、10:1、5:1、1:1的比例共培养，每组3个重复；

(3)培养4小时后置于分光光度计下计读数，计算PEMC细胞毒性效率。

7.根据权利要求1-6任一所述方法，其特征在于，所述恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液包括左股骨骨肉瘤肺转移伴左胸腔积液、右肱骨骨肉瘤肺转移伴右侧胸腔积液、骨盆骨肉瘤肺转移伴右侧胸腔积液。

8.权利要求1-6任一所述方法制备得到的PEMC在制备治疗恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述药物是一种以PEMC为主要成分的免疫治疗性疫苗。