[发明专利]一种获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法

说明书

本发明提供一种获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，包括如下步骤：将含有丙酮酸氧化酶的表达基因的重组大肠杆菌pET28a‑pod接种至固体培养基上进行活化，得到活化的重组大肠杆菌pET28a‑pod；将活化的重组大肠杆菌pET28a‑pod接种至放于摇床上的LB培养基并进行摇动，得到活化的重组大肠杆菌pET28a‑pod的种子液；接种该种子液至TB培养基进行培养，培养至浓度为第一细胞浓度后加入诱导剂进行诱导，当浓度为第二细胞浓度后不断加入盐酸溶液进行发酵至pH值为5.5‑6.5，然后继续诱导，得到菌液I；取菌液I进行离心后倒去上清液，用PBS溶液洗涤两次后用等体积的PBS溶液进行重悬，得到重悬液；对重悬液进行超声破碎，得到超声破碎后的菌液II；取菌液II进行离心，收集含有丙酮酸氧化酶的上清液。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法。

背景技术

丙酮酸氧化酶可用于丙酮酸、丙酮酸激酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、无机磷、唾液酸、唾液酸激酶以及尿素的检测，是生化检测试剂盒中十分重要的组成成分。近年来，有学者报道了可发酵生产丙酮酸氧化酶的野生型菌株，如植物乳杆菌、绿色气球菌和大肠杆菌。在这些野生型菌株中，来源于绿色气球菌的丙酮酸氧化酶因其良好的性能被作为生化检测试剂中的主要成分。但来源于绿色气球菌的丙酮酸氧化酶的发酵产量较低为120U/L，所以需要开发新技术以提高其产量。

基因工程技术是提高外源蛋白产量的良好选择。目前报道了一些表达外源蛋白的代表微生物，如巴斯德毕赤酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等。在所有重组微生物中，大肠杆菌因其清晰的遗传模式、高产量的重组蛋白被认为是表达外源蛋白中最成功的重组微生物。在生产发酵中，重组大肠杆菌具有高生长速率和易于控制培养的优点。因此，将来源于绿色气球菌中的丙酮酸氧化酶在重组大肠杆菌中表达是很合理的。参见参考文献1中Zhao等人构建了含有pSML载体的重组大肠杆菌，丙酮酸氧化酶的产量为670U/L。在我们之前的研究中，构建了重组大肠杆菌pET28a-pod，其中包含了进行密码子优化的丙酮酸氧化酶基因片段，经过诱导剂和温度优化后，丙酮酸氧化酶的产量达到了4106.9U/L参见参考文献2。但在扩大培养重组大肠杆菌表达丙酮酸氧化酶时，大量具有活性的丙酮酸氧化酶自发地形成了无活性的包涵体。因此，在后期更高密度培养中，需要降低丙酮酸氧化酶向包涵体变化的过程，最终才能得到高产量的可溶性丙酮酸氧化酶。

参考文献1：Zhao J,Wang Y,Chu J,Zhang S,Zhuang Y,Yuan Z(2008)Statistical optimization of medium for the production of pyruvate oxidase bythe recombinant Escherichia coli.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology 35(4):257-262(Zhao J，Wang Y，Chu J，Zhang S，ZhuangY，Yuan Z(2008)重组大肠杆菌表达丙酮酸氧化酶培养基的统计学优化，工业微生物和生物技术杂志，35(4):257-262)。

参考文献2：Lu J,Zhao Y,Zhang J(2018)High‐level expression ofAerococcus viridans pyruvate oxidase in Escherichia coli by optimization ofvectors and induction conditions.Lett Appl Microbiol.doi:doi:10.1111/lam.13013(Lu J，Zhao Y,，Zhang J(2018)优化质粒和诱导条件使重组大肠杆菌高效表达丙酮酸氧化酶的研究，应用微生物通讯，doi:doi:10.1111/lam.13013[A1])。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一直获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法。