[发明专利]一种重组变构胶原酶的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及重组变构胶原酶的纯化方法及其应用，公开了一种制备高纯度单一突变体胶原蛋白酶ColH的方法和所获得的产品。所述制备高纯度单一突变体胶原蛋白酶ColH的方法包括采用特定宿主菌BL21(DE3)表达E451D单点突变ColH变构胶原酶蛋白，经低温菌种发酵诱导后，提高目的蛋白产量。通过五步纯化：Capto Phenyl HS疏水层析；Capto Q阴离子交换层析；CaptoOctyl疏水层析；Phenyl HP疏水层析；Source 15Q阴离子交换层析后，获得了纯度98％以上的目的蛋白。生物学实验结果表明，此工艺生产的突变胶原蛋白酶纯度高，稳定性好，与之前的胶原蛋白酶商品相比具有明显的优势，酶比活显著提高。

技术领域

本发明属于生物制品制药技术领域，涉及重组变构胶原酶的纯化方法及其应用。

背景技术

胶原蛋白酶无论在医疗健康、生产实践及科研方面都有着广泛的应用，比如医学上用于清创、治疗腰椎间盘突出、治疗罕见病如杜普伊特伦挛缩与佩罗尼氏症等，并有望开发出溶脂、除疤、皮肤微整形的新药，生产上用于食品软化等，科研实验方面用于细胞分离、考古样本的处理等。

随着人们生活水平的日益提高，肥胖人群越来越常见，对爱美的人士来说肥胖是个大问题。目前减肥市场产品很多，脂肪抽吸术是一种应用较多的减脂方法。脂肪抽吸是一种借助仪器的物理方法，对身体有一定的损伤，抽吸部位的其他组织很容易损伤，也容易发生感染、瘀伤、血肿、深静脉血栓等副作用。目前，市场上还有激光辅助溶脂、超声辅助溶脂和注射溶脂等有创溶脂，还有冷冻溶脂、射频、超声等无创溶脂。

局部皮下脂肪团，例如双下巴，是一种比较常见的脂肪堆积现象，这种局部皮下脂肪团难以用运动进行消除。2015年，美国FDA批准了全球首个“双下巴”溶脂针Kybella(ATX-101)，用于中度至重度“双下巴”成人，该针剂是用于消除多余颏下脂肪(双下巴)的首个也是唯一一个非手术治疗产品。Kybella是人工合成的脱氧胆酸，其主要作用于细胞膜，而使细胞破裂，进而实现溶脂效果。由于脱氧胆酸的作用机理，Kybella的作用没有特异性，除脂肪细胞外，也能作用于其他细胞，因此有较大副作用，容易造成下颌缘神经损伤、咽下困难、注射部位血肿/瘀伤等。

随着胶原酶的发现和应用，其特殊的作用机制使得其能应用于溶脂领域。当前商业化的胶原蛋白酶(包括来自溶组织梭状芽胞杆菌的胶原蛋白酶)都是直接从生物样本中分离提取的，由于胶原酶在生物体中存在多种同工酶，这些商业化的品种往往是由5-6种胶原蛋白酶组成的混合物。即使经过高度纯化，具有相似的分子量和等电点(PIs)的ColH和ColG也是很难进行分离的。因此，来自溶组织梭状芽胞杆菌的高度纯化的胶原蛋白酶仍然是包含ColG和ColH的混合物。2015年上市的Xiaflex就是ColH和ColG两种胶原酶的混合物，而且纯度较低。

由于成分的非单一性，实际应用方面存在较多限制，比如在动物注射时容易引起出血，副作用不易把控。EijiTamai等的研究(EijiTamai等，High-level expression ofhis-tagged clostridial collagenase in Clostridium perfringen，ApplMicrobiolBiotechnol(2008)80:627–635)用产气荚膜梭菌分泌表达胶原酶ColH，为了便于纯化，ColH的C端带HIS标签。经过硫酸铵沉淀、锌柱亲和纯化、Mono Q阴离子交换层析等步骤得到纯度约90％的重组ColH。Paulina Ducka等的研究(Paulina Ducka等，Auniversal strategy for high-yield production of soluble and functionalclostridial collagenases in E.coli，ApplMicrobiolBiotechnol(2009)83:1055–1065)用大肠杆菌表达ColH，经镍柱亲和纯化、阴离子交换层析、分子筛层析得到纯度约90％的重组ColH。这些研究得到的ColH纯度及质量控制都难以达到临床应用要求。