[发明专利]一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA、表达载体、CRISPR-Cas9系统

说明书

本发明提供了一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA，包括用于敲除Dys基因43号内含子的gRNA和用于敲除Dys基因54号内含子的gRNA。本发明还提供了一种用于治疗杜氏肌营养不良的gRNA、表达载体、CRISPR‑Cas9系统，以及它们的用途。与现有技术相比，本发明可以覆盖不少于60％的DMD患者；利用CRISPR‑SaCas9系统，有利于使用AAV病毒作为治疗载体，更具有针对性，安全性高更高；本发明筛选出来的gRNA，具有较高的打靶效率，从而对Dys基因读码框的纠正效率更高。

技术领域

本发明涉及一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA、表达载体、CRISPR-Cas9系统及其用途。

背景技术

罕见病主要指发病率极低的慢性、退行性疾病。目前已知的罕见病超过7000种，其中80％是由于基因缺陷所致，具有遗传性。其实罕见病并不罕见，据统计，全球约有3.5亿罕见病患者，中国占2000多万，每年新出生的患者超过20万。我国主要依靠产前诊断和引产等手段控制罕见病群体扩大。但罕见病涉及基因复杂多样，发病机制不清晰，尚未列入婚检产检常规项目，国民和基层医疗卫生机构对该病的认知也有待加强，诊断技术尚未完善等，致使患儿出生率居高不下。罕见病患者一出生便面临“病无所医”、“医无所药”的窘境，因为目前可以治疗的罕见病仅占5％，另外95％无药可医。主要因为罕见病药物的研发难度高、成本大、受众少，极少医药企业愿意投入研发。面对全球7000多种罕见病，有特异性治疗作用的药物仅400-500种，而在我国上市的还不到20％，且绝大多数为进口药。

杜氏肌营养不良症，也称假肥大性肌营养不良(DMD)，是由抗肌萎缩蛋白基因(Dystrophin，Dys)突变所致，Dys基因全长约2220kb，含79个外显子，cDNA长14kb，是目前已知最大的人类基因。DMD为X染色体隐性遗传，主要为男孩发病，女性为致病基因的携带者，患病率约3.3/10万，占出生男婴的20-30/10万，其中约1/3为散发病例，没有家族病史。

长久以来，国内外均无针对DMD的有效临床干预措施或药物。2016年9月，美国FDA通过加快审批方式(仅进行了12例临床试验)批准了Sarepta Therapeutics公司的新药Exondys 51(Eteplirsen)注射液，该药是世界上第一款被批准用于治疗DMD的药物。Eteplirsen注射液只能针对Dys基因第51号外显子缺失的患者(约占DMD患者的13％)，且目前尚无足够的证据证明eteplirsen对DMD的治疗效果。Eteplirsen是一种靶向51号外显子的磷酰吗啉寡核苷酸，通过诱导Dys基因51号外显子跳读，使其mRNA阅读框不被破坏，从而促进抗肌萎缩蛋白的生成，使致死型DMD转变为临床表型较轻的贝克肌营养不良症(BMD)。除了Dys基因第51号外显子缺失，Dys基因的突变多集中在2-20号外显子区和45-53号外显子区。因此Sarepta Therapeutics公司还在开发另外7种外显子跳跃产品，它们通过跳过53、45、50、44、52、55和8号外显子治疗其他基因突变型的DMD患者。

Sarepta Therapeutics公司开发的外显子跳跃产品需要定期注射。随着科学的发展，通过基因编辑技术直接在基因组水平对遗传缺陷进行修正，被认为是治疗单基因遗传病的有效手段，且无需重复用药，一次治疗便终生有效。CRISPR-Cas9被誉为第三代基因编辑技术，其使用和设计更加简单，对目的基因的突变也更为高效，只要根据目的基因设计特异性的gRNA序列，即可引导Cas9在靶位点附近进行切割，产生双链断裂(double strandbreak,DSB)，断裂后的DNA双链可以通过非同源末端连接(NHEJ)的方式重新连接(如图1所示)。

现有技术采用Sp.CRISPR-Cas9基因编辑技术针对Dys基因内含子44和内含子55分别设计gRNA，诱导DNA双链切割并通过NHEJ连接，切除最容易产生突变的外显子45-55，纠正Dys基因的读码框，使其表达出有一定功能的抗肌萎缩蛋白。

然而针对Dys基因内含子44和内含子55设计的Sp.CRISPR-gRNA，其效率较低，直接导致DNA双链切割后NHEJ的效率也较低。