[发明专利]突变修饰的巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶及其制备方法和应用

说明书

突变修饰的巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶及其制备方法和应用，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。通过对P450_BM‑3单加氧酶基因的定向改造，选择的3个突变点R966L/K972L/W1046H使重组蛋白对辅酶NADH利用效率大为增加，是原酶对辅酶NADH利用效率的2.4倍，酶活达到11415 U/mg。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种突变修饰的巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶及其制备方法和应用。

技术背景

来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞色素P450_BM-3(又称CYP102A1)是一种可溶性的单加氧酶，它能够在生理条件下，催化长链脂肪酸的末端羟基化，不饱和脂肪酸的双键的环氧化等。(Munro AW,Girvan HM,McLean KJ:Cytochrome P450--redoxpartner fusion enzymes.Biochim Biophys Acta 2007,1770(3):345-359.)研究发现P450_BM-3单加氧酶主要由两个功能域组成：N端的P450功能域以及C端的NADPH-P450还原酶功能域。(Degtyarenko KN:Structural domains of P450-containing monooxygenasesystems.Protein engineering 1995,8(8):737-747.Guengerich FP,Martin MV,SohlCD,Cheng Q:Measurement of cytochrome P450and NADPH-cytochromeP450reductase.Nat Protoc 2009,4(9):1245-1251.)其中P450功能域含有血红素辅基(heme)，而NADPH-P450还原酶功能域又包括FMN、FAD和NAD结合域，这些结合域负责将电子从供体NADPH转移至P450功能域的血红素辅基，最终传递给分子氧，活化分子氧。这样的结构组成和排列保证P450_BM-3单加氧酶只需要脂肪酸底物和还原力NADPH就可以表现出优良的催化活性。(Nelson DR:The cytochrome p450homepage.Hum Genomics 2009,4(1):59-65.)尽管NADPH和NADH结构和生理功能极为相似，但是跟NADH相比，NADPH价格昂贵，稳定性较差。(Rosell A,Valencia E,Ochoa WF,Fita I,Pares X,Farres J:Complete reversalof coenzyme specificity by concerted mutation of three consecutive residuesin alcohol dehydrogenase.J Biol Chem 2003,278(42):40573-40580.)。国内外也有实现了各类细胞色素P450酶的异源表达及应用的研究报道，但均未进行该基因的辅酶特异性改变的突变修饰研究。因此，若能通过定向改造改变其基因序列，从而改变其辅酶特异性，可其该酶的适用性大大拓展，使用成本大大降低。细胞色素P450_BM-3酶单加氧酶的NADPH-P450还原酶黄素结合域与NADPH复合物晶体具有良好的分辨率(PDB ID：4DQL)，可以用于辅酶特异性的分析。利用DeepViewer软件对其A亚基的晶体结构进行系统分析，评估NADPH分子周围潜在的极性相互作用和空间位阻，具体评估结果见图1。发现在NADPH分子中磷酸基团范围内存在一个小的空腔，这个空腔里面含有一两个碱性氨基酸残基Arg⁹⁶⁶、Lys⁹⁷²和一个侧链羟基氨基酸残基Ser⁹⁶⁵。推测Arg⁹⁶⁶的侧链氨基、Lys⁹⁷²侧链的胍基和Ser⁹⁶⁵侧链的羟基能够与NADPH分子中的磷酸基团相互作用，形成稳定的氢键或离子键，这些相互作用有利于P450_BM-3单加氧酶对NADPH分子的识别，以及协助NADPH分子在复合体中的定位，从而使P450_BM-3单加氧酶对NADPH表现出特异性。于此同时，在4DQL晶体结构中，我们还发现氨基酸残基Trp¹⁰⁴⁶与FAD分子的异咯嗪环相互平行。根据电子在P450_BM-3单加氧酶中的流动情况分析，Trp¹⁰⁴⁶的吲哚基侧链体积相对较大，对FAD异咯嗪环的活动造成空间位阻，不利于电子从NADPH流向FAD，降低电子的传递效率，从而影响酶的催化效率。