[发明专利]提升大肠杆菌角鲨烯含量用质粒pCDAF及其制备和使用方法

权利要求书

1.一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，其特征在于，通过增生大肠杆菌的内膜进行；所述大肠杆菌为可合成角鲨烯的大肠杆菌E.coli CSQ1，所述大肠杆菌E.coli CSQ1是先通过将野生菌株E.coli C43(DE3)制备成氯化钙感受态细胞后，再通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得的，所述质粒pTsqs的核苷酸序列表如序列1所示。

2.一种质粒pCDAF，用于权利要求1所述大肠杆菌的内膜增生，其特征在于，包括载体pCDFDuet-1，载体pCDFDuet-1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDFori、链霉素抗性基因和ATP合酶b亚基基因atpF，ATP合酶b亚基基因atpF上游具有PT7启动子以启动ATP合酶b亚基基因atpF的表达；所述质粒pCDAF的核苷酸序列如序列2所示。

3.一种权利要求2所述质粒pCDAF的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先依据大肠杆菌E.coli CSQ1的基因atpF设计一对引物，之后以基因组为模板通过菌落PCR获得上下游分别含有NdeI与KpnI酶切位点的基因atpF，基因atpF的核苷酸序列表如序列3所示；

步骤2，先后通过酶切和连接方法将将步骤1得到的基因atpF插入载体pCDFDuet-1的NdeI与KpnI酶切位点之间，构建得到质粒pCDAF；

步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pCDAF进行验证。

4.根据权利要求3所述的质粒pCDAF的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，所述一对引物如下：

atpF_F_NdeI：5’-GGAATTCCATATGGTGAATCTTAACGCAACAATC-3’

atpF_R_KpnI：5’-CGGGTACCTTACAGTTCAGCGACAAGTT-3’

以基因组为模板，采用atpF_F_NdeI与atpF_R_KpnI引物扩增atpF基因即为上下游分别含有NdeI与KpnI酶切位点的基因atpF。

5.根据权利要求4所述的质粒pCDAF的制备方法，其特征在于，在所述步骤2中，采用NcoI与EcoRI两种限制性内切酶分别对基因atpF和载体pCDFDuet-1分别进行双酶切，然后利用T4链接酶将两者进行连接，最终得到质粒pCDAF。

6.一种利用权利要求2中所述质粒pCDAF提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先将大肠杆菌E.coli CSQ1制备成氯化钙感受态细胞，然后通过热击法将质粒pCDAF转入E.coli CSQ1，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得重组菌E.coliCSAF1；

步骤2，验证重组菌E.coli CSAF1中内膜增生；

步骤3，验证重组菌E.coli CSAF1中角鲨烯的合成。

7.根据权利要求6所述的利用质粒pCDAF提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，其特征在于，在步骤2的验证具体为：先采用LB液体培养基培养步骤1得到的重组菌E.coli CSAF1，并加入诱导剂IPTG诱导基因atpF表达，之后离心收集菌体，冷冻干燥过夜，最后通过电子扫面显微镜观察细胞内膜变化。

8.根据权利要求6所述的利用质粒pCDAF提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，其特征在于，在步骤3的验证具体为：先通过皂化法分离、提取合成的角鲨烯；再通过高效液相色谱法检测该角鲨烯。