[发明专利]用于检测支原体的荧光定量PCR引物、检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种用于检测支原体的荧光定量PCR引物、检测方法及应用，涉及病原体检测领域，基于现有技术无法快速、定量诊断细胞培养液中支原体的污染的问题而提出的，本发明包括用于检测支原体的荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法，本发明的有益效果在于：具有灵敏度高、重复性佳及快速检测等优势，并且其污染低和成本低廉等特点，可用于科研、生产及临床实验中的细胞培养液中支原体的定量鉴定。

技术领域

本发明涉及病原体检测领域，具体涉及一种用于检测支原体的荧光定量PCR引物、检测方法及应用。

背景技术

支原体是一种无细胞壁，形态多呈不规则球状、长丝状，可通过0.22μm滤菌器，并且能在无生命培养基中生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。细胞培养过程中，细胞易被支原体污染，国内外研究表明，98％以上细胞支原体污染是以下六种类型：口腔支原体(M.orale)、发酵支原体(M.Fermentans)、精氨酸支原体(M.arginini)、炎支原体(M.arthritidis)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)和菜氏无胆甾原体(A.laidlawii)。

由于其微小的尺寸(～100nm)，肉眼或光学显微镜无法探测到支原体，因此，它们通常会在较长时间内不被发现。此外，由于其缺乏细胞壁，它们对许多常见的抗生素有耐药性，如青霉素和链霉素。数以百计的支原体可以同时附着在一个真核细胞上，最终通过与细胞膜融合而侵入宿主体内。在进入细胞后，支原体快速繁殖，由于不能产生典型的与细菌或真菌污染有关的浊度，因此，不能将细胞培养液的支原体污染可视化。此外，在受影响的细胞培养过程中，随之发生的细胞形态学改变和改变的细胞生长速率并不明显，如何能高效、准确鉴定细胞样品是否有支原体污染已成为生物医药行业中亟待解决的重要问题。

现阶段对于细胞样品的支原体检测方法主要由3大类，即培养法、荧光染色法和PCR法的分子生物学检测。培养法是相对可靠的支原体检测技术，但是该方法非常耗时，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测方法。荧光染色法的灵敏度太低，当细胞样品被检测为阳性时，细胞经常已经被支原体严重污染。目前，通常使用PCR分子生物学检测细胞培养液中支原体污染。但是PCR法也有明显的缺点：(1)耗时长：整个过程大约需要3-4个小时；(2)操作复杂：细胞培养过程中，细胞培养液中经常含有严重抑制PCR产物扩增的代谢物，所以细胞培养液的前处理是PCR法不可或缺的环节；(3)高风险：PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，需要用到EB等潜在致癌物质，对实验人员造成潜在危险。

发明内容

本发明解决的技术问题在于现有技术无法快速、定量诊断细胞培养液中支原体的污染。

本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：

用于检测支原体的荧光定量PCR引物，所述引物对为上游引物：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3'，下游引物：5'-GATTACTAGCGATTCCGACTTCAT-3'。

优选的，所述支原体为细胞培养中污染的支原体。

优选的，所述支原体为口腔支原体、发酵支原体、精氨酸支原体、炎支原体、猪鼻支原体和菜氏无胆甾原体中的一种或多种。

优选的，所述引物对特异于细胞培养液支原体的16SrRNA基因。

优选的，所述引物对适用于SYBR Green实时荧光定量PCR技术的检测。

优选的，所述上游引物与下游引物摩尔比为1:1。

本发明还提供用于检测或辅助检测细胞培养液支原体的试剂盒，所述试剂盒含有上述引物对、dNTP、荧光染料、无菌双蒸水、模板。

优选的，所述荧光染料为SYBR Green。

优选的，所述试剂盒在检测或辅助检测细胞培养液支原体产品中的应用。