[发明专利]一种番石榴叶内生菌的分离方法

说明书

本发明公开了一种番石榴叶内生菌的分离方法，包括以下步骤：(1)在夏季采集具有10年以上树龄的新鲜番石榴老叶，低温放置；(2)对番石榴老叶进行表面灭菌处理得到备用叶片；(3)将步骤(2)中得到的备用叶片剪碎后，加入生理盐水与纤维素酶后研磨成匀浆，将匀浆稀释后涂布到培养平板上培养；(4)待培养平板上长出菌落时，挑选单菌落，进行划线分离纯化，即得到番石榴叶内生菌。本发明的方法特别适合于从番石榴叶中分离内生菌，其工艺步骤简单，操作方便。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种内生菌的分离方法。

背景技术

内生菌是指生活史全部阶段或者部分阶段生活在活的植物组织内，而同时又不引起植物明显病害症状的微生物。“内共生理论”认为与宿主共同进化的内生菌可能从宿主中获得相关基因的传递，具有合成与宿主相同或相似代谢产物的能力。1993年，首次从短叶红豆杉中分离得到一株能够产生抗癌物质—紫杉醇的内生真菌，进一步证实了“内共生理论”。植物内生菌产生的次级代谢产物是天然药用活性物质的重要来源，而且很大一部分天然产物是新型生物活性物质，具有广阔的应用前景。由于植物内生菌繁殖速度快、产生代谢产物种类多，加强对植物内生菌的开发和利用，是寻找和开发新药物的良好途径，具有良好的应用前景和开发利用价值。

番石榴叶中含有丰富的营养物质，新鲜成熟的番石榴叶中含有较高的蛋白质和可溶性糖。同时含有黄酮类、多酚类、三萜类、杂源萜类、挥发油、植物多糖等功能活性成分。研究表明番石榴叶提取物具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗微生物、抗腹泻、抗肿瘤及保护肝脏的作用。

现有技术中公布的内生菌分离方法并不能很好的适用于番石榴叶内生菌的分离，研究开发一种从番石榴叶中高效分离内生菌的方法能显著扩大番石榴的应用范围，具有广阔的市场价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种番石榴叶内生菌的分离方法，该方法特别适用于番石榴叶，其内生菌的分离效果更好。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种番石榴叶内生菌的分离方法，包括以下步骤：

(1)在夏季采集具有10年以上树龄的新鲜番石榴老叶，低温放置(在4℃下放置24h)；10年以上树龄的番石榴老叶具有的内生菌种类最多的特点，且夏季树叶生长茂盛是采集番石榴叶的最好的时期；番石榴叶在低温保存24h后，表面的微生物会受到抑制，有利于叶片表面消毒；

(2)对番石榴老叶进行表面灭菌处理得到备用叶片；表面灭菌处理的目的在于除去叶片表面的杂菌；

(3)将步骤(2)中得到的备用叶片剪碎后，加入生理盐水与纤维素酶后研磨成匀浆，将匀浆稀释后涂布到培养平板上培养；将匀浆稀释后涂布到培养平板上培养；番石榴叶为革质叶片，质地较坚固，研磨时加入一定量的纤维素酶可以分解植物纤维及细胞壁，可以促进内生菌的浸出；

(4)待培养平板上长出菌落时，挑选单菌落，进行划线分离纯化，即得到番石榴叶内生菌。

上述分离方法中，优选的，表面灭菌处理包括以下步骤：用自来水冲洗步骤(1)中经低温放置后的番石榴叶，将叶片放在无菌水中浸泡，同时加入2-3滴洗洁精，使用磁力搅拌仪低速搅拌30-60min，剔除损伤叶片后，用无菌水洗去叶片上残留的洗洁精；再将叶片用0.2-0.4％的二氧化氯溶液浸泡1-3min，用无菌水冲洗干净；最后将叶片用无菌水浸没在封闭容器中后放入超声消毒机，在10-15KHz、80-150W条件下，消毒10-20min，再用无菌水冲洗，吸干叶片表面的水分即得到备用叶片。番石榴本身具有抑菌活性，叶片表面上的微生物数量较少，可以用较低消毒剂的浓度和较短的消毒时间，同样可以达到表面消毒的目的，同时可以减弱消毒剂的渗透效果，避免内生菌受到伤害。为了保证消毒效果可以辅助使用超声消毒机，超声波处理可以降低消毒剂的残留，同时通过剪切力作用可以破碎植物细胞，加强破壁效果，可以促进内生菌的浸出。