[发明专利]一种番石榴叶内生菌的分离方法

权利要求书

1.一种番石榴叶内生菌的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在夏季采集具有10年以上树龄的新鲜番石榴老叶，低温放置；

(2)对番石榴老叶进行表面灭菌处理得到备用叶片；

(3)将步骤(2)中得到的备用叶片剪碎后，加入生理盐水与纤维素酶后研磨成匀浆，将匀浆稀释后涂布到培养平板上培养；

(4)待培养平板上长出菌落时，挑选单菌落，进行划线分离纯化，即得到番石榴叶内生菌。

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，表面灭菌处理包括以下步骤：用自来水冲洗步骤(1)中经低温放置后的番石榴叶，将叶片放在无菌水中浸泡，同时加入2-3滴洗洁精，使用磁力搅拌仪低速搅拌30-60min，剔除损伤叶片后，用无菌水洗去叶片上残留的洗洁精；再将叶片用0.2-0.4％的二氧化氯溶液浸泡1-3min，用无菌水冲洗干净；最后将叶片用无菌水浸没在封闭容器中后放入超声消毒机，在10-15KHz、80-150W条件下，消毒10-20min，再用无菌水冲洗，吸干叶片表面的水分即得到备用叶片。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(3)中，控制所述备用叶片与纤维素酶的质量比为1000：(0.8-1.2)。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)与步骤(3)之间还有消毒效果检验过程，所述消毒效果检验过程中使用的检验方法包括漂洗对照、印迹对照和环境对照3种方法。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(3)中匀浆稀释后涂布到培养平板上培养是指：将匀浆用无菌水分别稀释1倍、10倍、100倍、1000倍，分别取100uL稀释液涂布于分离平板上，每个处理重复3次，在30℃下恒温培养3-12d。

6.根据权利要求5所述的分离方法，其特征在于，所述分离平板包括内生真菌培养基、内生细菌培养基和内生放线菌培养基，所述内生真菌培养基使用PDA培养基，内生细菌培养基使用NA培养基，内生放线菌培养基使用高氏一号培养基，且所述内生真菌培养基、内生细菌培养基和内生放线菌培养基中均添加有番石榴叶浸出液。

7.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，所述番石榴叶浸出液的制备过程包括以下步骤：将番石榴叶片剪碎，与蒸馏水以体积比1：1的方式混合，煮沸后，小火熬煮30min，过滤获得清液即为番石榴叶浸出液。

8.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，所述内生真菌培养基、内生细菌培养基和内生放线菌培养基中添加的番石榴叶浸出液的体积占培养基体积的6-8％。