[发明专利]特异性靶向SATB1基因的sgRNA及其在转录激活中的应用

说明书

本发明提供一种制备特异性靶向目标基因SATB1的sgRNA，序列为SEQ ID NO.1，本发明利用Casilio系统特异性转录激活人Hela细胞中SATB1基因。本发明制备的特异性靶向人SATB1基因的sgRNA能够精确靶向人SATB1基因并且实现转录激活。本发明制备方法步骤简单、sgRNA靶向性好，SATB1转录激活效率高。本发明可以在较短时间内实现SATB1转录激活，与直接细胞内转染SATB1过表达质粒相比，更符合生理情况，且价格低廉，有助于进一步深入研究SATB1的生物学功能。

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及一种特异性靶向SATB1基因的sgRNA，以及利用该sgRNA通过Casilio系统特异性转录激活人Hela细胞SATB1基因的方法。

背景技术

规律成簇间隔短回文重复系统(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat；CRISPR-associated，CRISPR-Cas9)是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-strand breaks,DSB)。而核酸酶缺陷突变体dCas9则去除了Cas9的切割能力，仅保留了sgRNA介导的靶向能力。将转录激活因子P65HSF1及RNA结合蛋白Pumilio/FBF(PUF)融合表达，同时，在sgRNA后串联PUF结合位点，并与dCas9共同表达，可以利用sgRNA和dCas9将PUF结合位点靶向至目的基因，利用PUF与PUF结合位点结合，将转录激活因子P65HSF1靶向至目的基因，从而转录激活该基因。此系统称为Casilio系统(见图1)。

dCas9靶向DNA是通过向导核糖核酸(guide RNA，sgRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。sgRNA的特异性决定了基因编辑的精确程度。因此，设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR-Cas9基因敲除的关键技术。

SATB1是一类转录因子，具有转录目的基因等多个生物学功能。利用Casilio系统快速、简便、高效、特异性转录激活SATB1基因，有助于深入研究其功能。而能否设计、制备出精确性和特异性靶向SATB1基因的sgRNA以及通过分子生物学方法制备出靶向SATB1基因的Casilio系统成为实现SATB1基因激活的关键技术。

参考文献：

Ran,F.A.et al.,Genome engineering using the CRISPR-Cas9system.NATPROTOC 8 2281 (2013)。

Cheng,A.W.et al.,Casilio:a versatile CRISPR-Cas9-Pumilio hybrid forgene regulation and genomic labeling.CELL RES 26 254(2016).

发明内容

本发明的目的是提供一种制备特异性靶向目标基因SATB1的sgRNA，序列为：ttgcggaagaagcagatgtcagg(SEQ ID NO.1)。

本发明的另一个目的是提供所述sgRNA在转录激活靶向SATB1基因中的应用，是基于 Casilio系统特异性转录激活人Hela细胞SATB1基因，通过以下步骤实现。

1.靶向SATB1基因sgRNA寡核苷酸的设计和选择：

(1)在SATB1基因上选择特征为5’-N(19)GG或5’-N(20)GG-3’或5’-N(21)GG-3’的序列；

(2)sgRNA在SATB1基因上的靶向位点位于转录起始位点后200bp内；

按以上原则，设计得到sgRNA，序列为SEQ No.1。