[发明专利]特异性靶向SATB1基因的sgRNA及其在转录激活中的应用

权利要求书

1.一种制备特异性靶向目标基因SATB1的sgRNA，其特征在于，sgRNA的序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的sgRNA在转录激活靶向SATB1基因中的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）sgRNA寡核苷酸的设计和选择：

（2）利用sgRNA，合成可以连入pAC-sgRNA-5×PBSa真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸；

（3）将sgRNA构建至pAC-sgRNA-5×PBSa载体，鉴定并扩增：

（4）转染Hela细胞并转录激活SATB1：

（a）按照jetPRIME DNA & siRNA Transfection Reagent的操作手册，用 800ng脂质体装载的pAC-SATB1 sgRNA-5×PBSa 质粒、400ng的pmax-dCas9质粒以及800ng的pAC1393 -PUFa-P65-HSF1质粒，分别转染至Hela细胞；其中pmax-dCas9质粒的序列如SEQ No .7所示，pAC1393 -PUFa-P65-HSF1质粒的序列如SEQ No.8所示；

（b）转染48小时后收集转然后的Hela细胞，提取总RNA和总蛋白，Real time Q-PCR及Western Blot确认SATB1被转录激活。

3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）具体操作为：在SATB1基因上选择特征为5’- N(19)GG或5’-N(20)GG-3’或5’-N(21)GG-3’的序列；sgRNA在SATB1基因上的靶向位点位于转录起始位点后200bp内；按以上原则，设计得到sgRNA，序列为SEQ No.1；

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）具体操作为：

（a）根据选择的sgRNA，去除3’端NGG三个碱基，在其5’端加上CACCG得到正向寡核苷酸；根据选择的sgRNA，去除3’端NGG三个碱基，获得对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC,3’端加上C得到反向寡核苷酸，上述正向、反向寡核苷酸序列见SEQ NO.2和SEQ NO.3；

（b）分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，合成可以连入pAC-sgRNA-5×PBSa真核表达载体的双链。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（3）具体操作为：

（a）将退火的sgRNA寡聚核苷酸双链与序列如SEQ NO.4所示的pAC-sgRNA-5×PBSa载体连接，获得序列如SEQ NO.5所示的pAC-SATB1 sgRNA-5×PBSa质粒；

（b）pAC-SATB1 sgRNA-5×PBSa质粒转化感受态细菌并涂 Amp+平板；

（c）对pAC-SATB1 sgRNA-5×PBSa质粒进行鉴定：挑选阳性克隆并用序列如SEQ IDNO.6所示的通用引物 U6 测序的方法鉴定阳性克隆，37℃摇床摇阳性克隆菌过夜并用抽提pAC-SATB1 sgRNA-5×PBSa 质粒。