[发明专利]一种棉花紫化突变体HS2的特异性鉴定引物及其应用

说明书

本发明公开了一种棉花紫化突变体HS2的特异性鉴定引物及其应用，所述特异性鉴定引物为HS2A和HS2APF、HS2B和HS2BPR两对引物中的一对或两对；本发明特异性引物HS2A和HS2B是通过PCR技术实现的，与本发明的棉花紫化突变体HS2的紫化突变性状共分离并呈特异带型，不仅能快速有效地区分棉花品种/品系的基因型，而且还能直接鉴定种质资源和育种后代中的紫化性状是否来源于HS2紫化突变体材料或衍生系，可以在育种进程的任何阶段进行，不受任何外界因素的影响，极大地缩短了育种进程，提高了育种效率。

(一)技术领域

本发明涉及一种棉花整个植株呈现紫化突变的特异性引物HS2A和HS2B及其检测棉花紫化性状中的应用。

(二)背景技术

棉花是目前世界上附加值最高的天然纺织纤维，其经济价值的90％来自于棉纤维。棉花作为我国重要的农产品和纺织工业原料，对农业、农村乃至国民经济的发展均有重要意义。虽然多个棉种全基因组测序已完成，基因组序列信息中积累了大量有用的信息，但是许多新基因的功能仍然不清楚，挖掘一些有意义的新基因和功能基因已经成为目前基因组学研究的最为紧迫的任务。而棉花作为对国民经济中起重要作用的经济作物，随着棉花基因组序列的公布，棉花的功能基因组研究必将再次成为国际植物研究热点。但陆地棉是异源四倍体，基因组结构非常复杂，棉花基因组学的研究也非常缓慢，而通过T-DNA插入突变研究棉花的功能基因尚未报道。

植物自发突变通常是在自然条件下，无人为因素介入的情况下发生的变异。王学德2002年报道发现了一棵无纤维棉花突变体，为棉花纤维发生机理研究及棉纤维相关基因的克隆提供了材料(蒋淑丽，王学德，5个棉花纤维突变体胚珠和纤维的离体诱导，棉花学报,2002,14(2):71-75,2002)。陈旭升等从陆地棉中分离出自然突变的具有高光合效率的亚红株突变体，随后又发现了自发突变矮化株(陈旭升，棉花矮秆突变体，中国棉花,2004,31(1):26-26；陈旭升，陆地棉亚红株新突变体；中国棉花，2004,31(12):19-19)。由于自发突变的低概率事件，加上棉花遗传背景的复杂性，有些即使发现一些表型变异，也很难用分子机理验证，而最终导致自发突变体库资源流失。物理和化学方法创造突变体是在基因水平上创造突变体的一种方法，在棉花上也有相应的研究。如1955年Maluszyns利用γ射线辐照得到了耐热和早熟的棉花杂交后代突变体(Maluszynskl,Application of in vivo andin vitro mutation techniques for crop improvement.Euphytica,1995,85:303-315)。山东省农科院利用γ射线处理得到的中棉所2号和1195系的杂交组合突变体，表现出结铃性强、成熟早、抗抗逆性强的的特性。在1987年，化学诱变就已经成为植物诱变育种的一种重要方法(Mike,Donini,Maluszynski.Induced mutations for crop improvement.TropAgric,1987,64:259-278)。沈法富曾将叠氮化钠(NaN₃)在棉花合子期导入鲁棉6号，获得早熟突变体(沈法富,棉花合子期化学诱变获得的早熟品系及其RAPD分析.遗传学报,1999,26(2):174-187)。对于背景比较复杂的棉花，和自发突变一样，往往很难分析突变点，加上诱变时嵌合株产生率高，容易导致细胞死亡、恶性转化等(Hagen.Radiation biology inspace.A Critical Review Adv Space Research,1989,9(10):3-8)，因此由于其难控制性，目前在棉花育种中应用受到一定限制。在棉花组织培养的基础上，创制一些有意义的突变体，Trolinder等1991年利用高温诱导棉花愈伤组织，获得棉花不育耐旱突变体(Trolinder,Shang.In vitro selection and regeneration of cotton resistant tohigh temperature stress.Plan Cell Rep,1991,10:448-452)。1998年通过在愈伤组织培养基中添加根腐病毒素获得该抗性植株。Jin等在G.hirsutum体细胞胚胎发生的不同时期添加2,4-D和KT成功诱导体细胞无性系变异再生植株(Jin et al.Detection ofsomaclonal variation of cotton(Gossypium hirsutum)using cytogenetics,flowcytometry and molecular markers.Plant Cell Rep,2008,27(8):1303-1316)。祝水金等利用无性系细胞培养液获得了抗除草剂草甘膦突变体(祝水金等,棉花抗草甘膦突变体筛选及其在杂种优势利用中的应用.棉花学报,2003,15(4):227-230)。棉花组织和细胞培养产生的体细胞无性系变异在抗逆、抗病方面有一定的进展，但是由于突变的不确定性，需要庞大的突变体系才能得到一些有意义的突变体，而且在棉花高产、优质方面研究甚少，同时通过组织培养获得突变体效率较低。植物突变群体的构建方法中，插入突变是一种重要的方法。插入突变是将外源的已知插入元件随机插入植物基因组中，引起插入位点基因的变化，影响其正常表达，进而导致植株在表型上的变化，产生插入突变体，并以此插入元件为标记来分离和克隆因插入而失活的基因(Krysan et al.,T-DNA as an insertionalmutagen in Arabidopsis.Plant cell,1999,11:2283-2290)。目前常用的插入元件有T-DNA、转座子等，而T-DNA插入是构建突变体库的主要方法，广泛应用于大规模植物基因功能分析，是用来研究新基因功能的有效工具。T-DNA插入技术在农杆菌和基因枪介导的基础上已被广泛应用于拟南芥、水稻等植物大量突变体库构建中(Azpiroz et al.,T-DNAinsertion mutagenesis in Arabidopsis:going back and forth.Trends Genet,1997,13(4):152-156；Bouche et al.,Arabidopsis gene knockout phenotypes wanted.CuurOpin Plant Biol,2001,4:111-117)。T-DNA插入不但可以获得大量突变体，而且转化载体所携带的报告基因还可作为基因诱捕，克隆整合位点处内源基因的标签，分离和鉴定与突变体相关的基因。到目前为止在拟南芥有40％的新基因是通过T-DNA介导的基因诱捕技术分离的(Meinke et al.,The preservation of plant genetic resources experienceswith Arabidopsis.Plant Physiology,2003,133:1046-1050)。如今至少有225,000多个拟南芥T-DNA插入突变体被构建，其中360,000个T-DNA插入位点序列被分析捕获，这几乎可以代表拟南芥的整个基因组(Li et al.,Gene traping techniques and currentprogress.Yi Chuan Xue Bao,2006,33:189-198)。然而，棉花的生物技术相对于其它作物落后，规模化的转基因比较困难，表现在基因型依赖性，转基因周期长，再生、移栽困难，可重复性差等，利用转基因技术构建T-DNA插入突变体库十分困难。