[发明专利]一种全自动在线检测血清中自由态小分子化合物的方法

说明书

一种全自动在线检测血清中自由态小分子化合物的方法，包括：(1)利用双三元液相色谱仪的自动进样器直接吸取血清样品，向净化柱正向加载，并对分析柱进行冲洗；(2)在血清样品加载完成后，对所述净化柱反冲洗脱目标化合物，并对所述分析柱进样；(3)在反冲洗脱阶段结束后，进行自由态小分子化合物质谱检测。本发明的方法能快速又准确的直接分析出血清中与蛋白具有低、中、高结合率的小分子化合物的自由态浓度，解决了传统仪器分析方法前处理过程耗时耗力的问题。

技术领域

本发明涉及血清检测技术领域，尤其涉及一种全自动在线检测血清中自由态小分子化合物的方法。

背景技术

近年发展起来的在线固相萃取液相色谱技术能够实现样品的在线富集，最大程度减少人工操作和人为误差，以其自动高效的特点正逐渐应用于环境、生物等样品中痕量目标物的分析。在线湍流固相萃取柱(TurboFlow-SPE)的填料特点是结合了体积排阻和反相色谱的保留特性，由于填料颗粒物尺寸较大(60μm)，样品在高流速状态下呈湍流状态，可去除大分子，保留小分子；TurboFlow-SPE技术已被用于水样、尿样及血液样品中痕量污染物的检测，但目前尚没有血清中针对自由态小分子化合物的全自动在线湍流固相萃取检测技术的相关报道。

现有技术方案中，针对血清中自由态小分子化合物的常用检测方法是：通过半透膜或者超滤的方法将样品中自由态小分子的分离与提取，然后再经过一系列前处理进行浓度检测，但通常提取过程步骤复杂，在提取完成后至进入分析仪器前还需进行一系列前处理。并且这些传统方法需要消耗大量的时间和人力，需要的样品量较大，基质去除效果不理想，同时前处理过程也因提取小分子方法不同而不同，并且实验结果受到实验人员操作的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种全自动在线检测血清中自由态小分子化合物的方法，该系统无需再经过复杂的人工前处理过程，直接将血清引入分析检测系统，解决了传统血清中自由态检测分析方法前处理过程耗时耗力的问题。该方法无需人工处理，避免了人工操作带来的实验误差，因此重现性良好，提高了检测效率以及检测结果的准确性。

一种全自动在线检测血清中自由态小分子化合物的方法，包括：

(1)利用双三元液相色谱仪的自动进样器直接吸取血清样品，向净化柱正向加载，并对分析柱进行冲洗；

(2)在血清样品加载完成后，对所述净化柱反冲洗脱目标化合物，并对所述分析柱进样；

(3)在反冲洗脱阶段结束后，进行自由态小分子化合物质谱检测；

其中，所述双三元液相色谱仪的左泵和右泵所使用的流动相溶剂按如下方式配制：

左泵流动相：A：超纯水；B：乙腈；C：甲醇∶乙腈∶水∶异丙醇＝1∶1∶1∶1；右泵流动相：A：10mmol/L醋酸铵，pH＝5；B：乙腈；C：甲醇∶乙腈∶水∶异丙醇＝1∶1∶1∶1。

优选地，所述方法的在线固相萃取以及液相色谱加载和洗脱条件为：

其中，a.表示样品负载和样品分析过程六通阀位置；b.表示样品洗脱过程六通阀位置。

优选地，10mmol/L醋酸铵溶液的配制方法为：取0.77g醋酸铵，与990mL超纯水混合，用冰醋酸调节pH至5后，再加水稀释至1000mL后混匀。

优选地，所述净化柱采用湍流固相萃取柱Turboflow Cyclone-P、TurboflowCyclone、C18色谱柱或者C18-P XL色谱柱。

优选地，所述分析柱采用硅胶基质碳18反相色谱柱Acclaim 120C18、ZorbaxExtend C18色谱柱或者Waters sunfire C18色谱柱。