[发明专利]喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlT及鉴定

说明书

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，公开了一种喜盐芽胞杆菌新型钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlT及鉴定，喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlT是完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；鉴定方法包括首先得到含有耐盐碱基因的片段；构建含有sdmlT基因的原核表达载体；对该基因的生理功能以及其编码的蛋白功能进行了鉴定。本发明从安达喜盐芽孢杆菌中获取的sdmlT基因可使大肠杆菌(Escherichia coli)盐敏感突变株KNabc的耐盐碱能力有了显著的提高；本发明所提出的sdmlT基因丰富了微生物耐盐碱基因资源，可用于构建高效的耐盐碱工程菌或抗逆型作物等，特别是耐盐或耐碱胁迫的植株具有重大价值。

技术领域

本发明属于生物学和基因工程技术领域，尤其涉及一种喜盐芽胞杆菌钠/氢 逆向转运蛋白基因sdmlT及鉴定。

背景技术

环境中如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严 重时会造成农作物大规模减产。其中，盐碱被认为是最具危害性的非生物类胁 迫因素之一。高盐碱环境不仅对细菌细胞本身产生毒害作用，而且高浓度的渗 透压和离子压力也严重影响了细菌的正常生理功能。同时，在农业生产上具有 重要经济价值，并可作为微生物肥料的细菌耐盐碱能力却十分有限，诸如根瘤 菌、固氮菌、磷细菌、钾细菌和根际促生菌等，这严重制约着其在农业生产中 的应用前景。解决其最为有效的办法之一就是从耐盐碱细菌中克隆高效的耐盐 碱基因，再将其导入可用作为微生物肥料的细菌，以构建高效耐盐碱基因的工 程菌株。所以，细菌耐盐碱基因的克隆与功能鉴定及其耐盐碱分子遗传机制的 研究在过去的几十年中一直是一个重要的研究课题。

在原核生物中，Na⁺/H⁺逆向转运蛋白是普遍存在的次级转运蛋白，它催化胞 内碱性阳离子如Na⁺，Li⁺或K⁺的流出，以置换外部质子，这在对减少有毒碱性 阳离子的胞质浓度和在碱性条件下维持细胞内pH稳态都起着至关重要的作用 (Padan E，1994；Ito M，1999；Quinn MJ，2012)。由于Na⁺/H⁺逆向转运蛋白 同时还具有Li⁺/H⁺逆向活性，因此也称为Na⁺(Li⁺)/H⁺逆向转运蛋白。其中有 些报道有时候会显示出K⁺/H⁺逆向转运活性(Ito M，1999；Quinn MJ，2012)。 根据基因的功能，人们将细菌中的耐盐碱基因主要分为三大类：(1)编码渗调 蛋白的基因：此类基因编码的渗调蛋白主要负责细菌在盐碱压力下初期对渗透 压变化的响应，起到的主要是缓冲作用。(2)编码全细胞调控因子的基因：这 类基因则是从全细胞水平启动细胞整体调控应对机制。(3)编码阳离子转运蛋 白的基因：其功能主要是解除Na⁺、Li⁺、K⁺等阳离子在细胞内积累所造成的毒 害作用以及维持碱性pH值条件下的细胞内pH值平衡的最终执行者。因此，阳 离子转运蛋白在细菌耐盐碱方面起到决定性作用。

在细菌中发现的能够输出Na⁺的主要基因包括：负责向细胞内输入H⁺同时 向细胞外输出Na⁺或Li⁺的钠(锂)/氢逆向转运蛋白基因、通过脱甲基偶联输出 Na⁺的甲基四氢叶酸甲烷喋呤辅酶M甲基转移酶基因、通过偶联ATP产生输入 Na⁺的F-ATP酶或P-ATP酶基因或通过水解ATP输出Na⁺的V-ATP酶基因、通 过还原泛醌输出Na⁺的NADH泛醌氧化还原酶基因以及在控制脱掉羧酸的过程 中偶联Na⁺输出的脱羧酶基因。在各类阳离子输出蛋白中，钠(锂)/氢逆向转 运蛋白在输出Na⁺、Li⁺等阳离子以及维持细胞内pH值平衡起到的作用最为显著。