[发明专利]喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlT及鉴定

权利要求书

1.一种喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlT，其特征在于，所述喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlT是一个完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列为SEQ IDNO.1；

利用所述喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlT编码的蛋白SdmlT，氨基酸序列为SEQ ID NO.2；

所述蛋白SdmlT由442个氨基酸残基组成，并且具有Na⁺(Li⁺、K⁺)/H⁺逆向转运蛋白活性，所述活性具有pH依赖性。

2.一种如权利要求1所述喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlT的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括以下步骤：

(1)通过基因文库和功能互补相结合的方法，选取安达喜盐芽孢杆菌作为分离耐盐碱基因的供体，利用盐敏感缺陷株E.coli KNabc的生理特性，以0.2M NaCl的氨苄抗性固体培养基作为筛选工具，首先得到含有耐盐碱基因的片段；

(2)利用生物信息学软件对基因片段进行分析，确定耐盐碱的基因，通过PCR扩增得到sdmlT基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；构建含有sdmlT基因的原核表达载体；

(3)通过基因功能互补的方法，首先对该基因的生理功能进行鉴定；再通过荧光猝灭技术手段，对sdmlT基因编码的蛋白功能进行鉴定。

3.如权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述构建含有sdmlT基因的原核表达载体为构建pET19-sdmlT原核表达载体，构建方法包括：

根据sdmlT基因序列，首先利用Primer5软件设计特性引物sdmlT-F、sdmlT-R特异引物，并在基因的5’和3’端分别引入Nde I、BamH I两个酶切位点，然后进行sdmlT的PCR扩增；

引物sdmlT-F、sdmlT-R序列为：

sdmlT-F：CATATGATGTCCAGTTCAGCTGAAAG

sdmlT-R：GGATCCTTACATTAGCAACGGAATAA

将PCR扩增产物末端加“A”后连入pEASY-T3载体，将其转化到Trans1-T1感受态细胞中，进行蓝白斑筛选出亚克隆；再用Nde I、BamH I两种内切酶处理连有sdmlT的pEASY-T3-sdmlT，并同时对空载体pET19b做相同处理，对处理后的空载体pET19b和sdmlT片段进行连接，通过热激法将构建好的表达载体pET19-sdmlT导入异源表达宿主E.coli KNabc中，导入方法具体如下：

取E.coli KNabc感受态细胞，向其中加入适量的pET19-sdmlT重组质粒，轻轻混匀，冰浴30min；然后将盛有上述混合物的离心管置于42℃水浴中热激90s；之后快速移至冰浴，放置10min；再将入37℃预热的新鲜培养基进行复苏45min；最后，取适当体积均匀涂布在含有氨苄抗性的LBK培养基上；

所述荧光猝灭技术手段，包括：以吖啶橙AO作为荧光探针，检测荧光猝灭及恢复情况；向盛2.5mL缓冲液B的石英杯中加入2μM荧光探针吖啶橙AO和40μg的反转膜，抽吸混匀；再加入终浓度为5mM的Tris-D-乳酸并混匀反应体液；乳酸作为底物，通过呼吸链产生跨膜pH梯度ΔpH，此时荧光强度已开始下降；利用荧光分光光度计来监控跨膜pH梯度的变化；

荧光监控参数设置：激发光EX波长492nm，发射光EM波长526nm；当荧光强度下降至稳定状态时，向反应体系加入终浓度为5mM的NaCl、KCl、LiCl，以破坏pH梯度ΔpH，此时荧光强度开始升高；根据荧光强度的恢复程度判断并表示Na⁺(Li⁺，K⁺)/H⁺逆向转运蛋白活性的有无及大小。

4.一种如权利要求1所述喜盐芽胞杆菌钠/氢逆向转运蛋白基因sdmlT，其特征在于，所述该蛋白SdmlT使肠杆菌K12 dctA基因敲除突变株进行Na+(Li+、K+)/H+逆向转运。