[发明专利]一种测定生物样品中姜黄素和紫杉醇含量的HPLC分析方法

权利要求书

1.一种测定生物样品中姜黄素和紫杉醇含量的HPLC分析方法，依次包括标准曲线的建立和样品检测两个步骤，其特征在于，HPLC分析方法的条件为：采用4.6 mm × 250 mm的Luna ® 5 μm C18色谱分析柱，采用梯度洗脱变波长方法：0 ~ 9.5 min时，检测波长为425nm，流动相为乙腈和磷酸缓冲液，乙腈和磷酸缓冲液的体积比为55:45；9.51 ~ 11.5min时，检测波长为227 nm，流动相为乙腈和磷酸缓冲液，乙腈和磷酸缓冲液的体积比为40:60；柱温30℃，流动相流速为1 mL / min；所述磷酸缓冲液是由磷酸和三乙胺配制的pH=3.5的混合液；

还包括待测样本制备步骤，具体操作如下：向血浆样品或者匀浆后的动物组织样品中加入柠檬酸缓冲液，混合均匀，加入8～12倍的体积的萃取溶剂，混匀并离心，取有机层，氮气挥干，加入复合溶剂，混匀，离心取上清液即为供试液；所述萃取溶剂为乙酸乙酯和甲醇配制而成，两者的体积比为90:10。

2.如权利要求1所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述HPLC分析方法的条件还包括：在11.51 ~ 19.0 min时，检测波长为425 nm，流动相为乙腈和磷酸缓冲液，乙腈和磷酸缓冲液的体积比为55:45。

3.如权利要求1或2所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述标准曲线的建立包括以下步骤：

（1）对照品溶液的配制：将姜黄素、紫杉醇及姜黄素和紫杉醇分别溶于甲醇，制备成相同浓度的姜黄素储备液、紫杉醇储备液及姜黄素和紫杉醇混合储备液，再用甲醇稀释为系列梯度浓度的标准溶液；

（2）标准曲线的建立：分别取系列浓度的姜黄素、紫杉醇及姜黄素和紫杉醇混合的标准溶液与待测样品对应的空白生物样品混合得混合液，并对混合液进行样品前处理得供试液，然后在所述HPLC分析方法的条件下利用HPLC测定含量，以样品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归，建立标准曲线。

4.如权利要求3所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述样品检测步骤为取待测样品进行样品前处理得到供试液，然后在所述的HPLC分析方法的条件下利用HPLC测定含量，根据上述标准曲线和峰面积计算样品中姜黄素和紫杉醇的浓度。

5.如权利要求4所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述复合溶剂为乙腈和磷酸缓冲液配制而成，两者体积比为75:25。

6.如权利要求5所述的HPLC分析方法，其特征在于，样品前处理的具体方法如下：

取定量混合液置于5 mL 离心管中，加入25 μL pH 3.6的 CA 缓冲液，涡旋混合30 s，加入定量萃取剂，萃取剂是体积比为90：10的乙酸乙酯和甲醇，涡旋3 min，8000 rpm/min离心3 min，取上清液；再次加入萃取剂重复萃取一次，合并2 次上清液；氮气吹干，加入200 μL 复合溶剂，复合溶剂是乙腈和pH 3.5的磷酸，涡旋混合4 min，超声4 min，10000 rpm/min离心10 min，取上清液20 μL 进行HPLC 检测。

7.如权利要求1所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述待测样品为家兔样品时，所述标准溶液与空白生物样品的体积比为1:10，所述待测样品为大鼠样品时，所述标准溶液与空白生物样品的体积比为1:2。