[发明专利]一种快速检测黄牛ACTL8基因SNP的RFLP方法

说明书

本发明公开了一种快速检测黄牛ACTL8基因SNP的RFLP方法，包括以下步骤：该方法是以黄牛全基因组DNA为模板，利用1对PCR引物，在PCR条件下进行扩增，然后利用限制性内切酶消化PCR扩增产物，再对酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行片段大小分离，从而确定其SNP。本发明是一种在DNA水平上筛检与黄牛生产性状密切相关的分子遗传标记，可用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择，该方法操作简单、快速，成本低，而且检测的精确度高，便于推广应用。

技术领域

本发明属于分子遗传学技术领域，涉及一种快速检测黄牛ACTL8基因SNP的RFLP方法，具体地说，涉及一种快速检测肌动蛋白样蛋白8(Actin-like 8，ACTL8)基因单核苷酸多态性(SNP)的限制性片段长度多态性(RFLP)方法。

背景技术

所谓单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。SNP属于第三代分子标记，具有密度高、双等位基因、易实现自动化检测等优点。由于SNP具有其它标记无法比拟的优点，所以它作为一种研究工具已经在生命科学的各个领域得到广泛应用。

目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：DNA序列测定方法、PCR-SSCP(单链构型多态性)与DNA测序相结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应、PCR-RFLP方法等。在这些SNP检测技术中，①DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；②当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阴性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；③AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，不具有普遍应用的特点；④引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。综上所述，现有方法不是一种检测具有限制性酶切位点SNP的理想的遗传标记方法。

ACTL8基因在肌肉生长发育和细胞骨架中所发挥的生物学功能极为重要，对肌细胞运动、信号传递、物质运输等活动起主导作用。该基因多态与牛体重、体高、十字部高、体斜长等性状存在显著相关(P<0.05)。国内外尚无黄牛ACTL8基因遗传变异及其与生长性状关系的研究报道。由于目前中国黄牛ACTL8基因遗传变异领域的研究匮乏，使该基因位点的功能研究及该基因遗传变异与生长性状(如：尻长、坐骨端宽和胸围等性状)关联的研究成为空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测黄牛ACTL8基因SNP的RFLP方法，是一种利用限制性内切酶对包含该单核苷酸多态性位点的基因序列进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行片段大小分离，利用凝胶成像系统分析其片段大小，从而确定其SNP。

其具体技术方案为：

一种快速检测黄牛ACTL8基因SNP的RFLP方法，包括以下步骤：

以黄牛血液全基因组DNA为模板，在2×Taq PCR MasterMix存在的情况下，利用1对PCR(聚合酶链式反应)引物，在PCR条件下进行扩增，然后利用限制性内切酶对其进行酶切，再通过电泳检测即可鉴定黄牛ACTL8基因外显子区SNP。

进一步，所述的PCR扩增1对PCR引物包括：

上游引物Forward primer:5'-CCTGGCTCTTCCTGATCCTC-3'和下游引物Reverseprimer:5'-TCCTCCTTCGTCAGCCACTC-3'；