[发明专利]METTL3基因敲除的细胞系及其构建方法与干扰载体

说明书

本发明公开了一种METTL3基因敲除的细胞系及其构建方法与干扰载体。METTL3基因敲除的细胞系，利用m6A甲基转移酶基因Mettl3在通过基因编辑方法获得耐受LPS刺激导致脂肪酸吸收障碍的猪肠道上皮细胞系。一种耐受LPS刺激导致脂肪酸吸收障碍的猪肠道上皮细胞系。一种针对猪源m6A甲基转移酶基因Mettl3的基因干扰载体。本发明公开了Mettl3基因的一种新功能，参与调控肠道上皮细胞脂肪酸吸收转运，并提供了通过基因编辑手段改善LPS刺激导致的脂肪酸吸收障碍的方法。本发明不仅为研究Mettl3在脂肪酸吸收过程中的作用奠定基础，还利用基因编辑的方法改善了LPS刺激导致的脂肪酸吸收障碍。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种METTL3基因敲除的细胞系及其构建方法与干扰载体。

背景技术

我国现在普遍采用集约型模式进行养猪生产，生猪在每个生长环节都会受到病原微生物的感染，容易造成仔猪肠道（屏障）功能损伤，导致养分消化吸收障碍，并往往伴随着抵抗力下降和较严重的腹泻。在主要养分中，又以作为主要能量物质的脂肪酸的吸收利用影响较大。针对这一现象，目前主要采取抗病育种和长期高剂量添加药物两方面的措施。由于抗病育种世代周期长和普及面小等问题难以大范围推广，因此目前普遍采用的措施是长期高剂量添加饲用抗生素和氧化锌，然而其存在的问题也是显而易见的：极易引发细菌耐药性、肉产品残留、扰乱动物肠道微生态区系平衡、环境污染。因此寻求解决这一问题的新方法迫在眉睫。

m6A甲基化的修饰主要位于mRNA的腺苷A第六号氮原子上，是一种动态可逆的RNA修饰，Mettl3作为其甲基转移酶，通常和Mettl14形成复合物，执行写入m6A的功能。有文章报道， Mettl3所调控的RNA甲基化水平变化参与到生物机体从基因的转录到蛋白质的翻译的整个过程，如敲除Mettl3能够显著提高神经胶质瘤干细胞或类干细胞的增殖和自我更新(Cui et al., 2017)；Mettl3能够介导m6A依赖的cir-RNA的翻译(Yang et al., 2017)；Mettl3能够通过与DNA启动子区域相结合，调控基因转录，发挥着基因转录开关的作用(Barbieri et al., 2017)；敲除Mettl3能够通过阻止炎症相关通路关键因子MyD88的剪切，进而阻止炎症反应的发生(Feng et al., 2018；江一舟等，2017)；同时有文章报道Mettl3在成脂分化过程中能够通过促进细胞周期进而促进脂肪生成(Batista et al.,2014)。但是其在脂肪酸吸收转运过程中的作用，尚未报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种METTL3基因敲除的细胞系及其构建方法与干扰载体。

一种METTL3基因敲除的细胞系的构建方法，利用m6A甲基转移酶基因Mettl3在通过基因编辑方法获得耐受LPS刺激导致脂肪酸吸收障碍的猪肠道上皮细胞系。

所述的建立方法，包括以下步骤：

1）根据所述的m6A甲基转移酶基因Mettl3设计shRNA，

所述的Mettl3序列如SEQ ID NO.1所示，所述的shRNA序列如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3所示；

2）针对m6A甲基转移酶基因Mettl3 shRNA进行磷酸化；

3）将磷酸化的Mettl3 shRNA连接到慢病毒表达载体获得Mettl3 shRNA慢病毒表达载体；

4）以293A细胞作为受体，将步骤3）获得的Mettl3 shRNA慢病毒表达载体进行慢病毒包被；

5）将步骤4）获得的Mettl3 shRNA慢病毒侵染肠道上皮细胞，利用嘌呤霉素进行筛选，获得基因编辑敲除m6A甲基转移酶基因Mettl3的肠道上皮细胞。