[发明专利]METTL3基因敲除的细胞系及其构建方法与干扰载体有效
| 申请号： | 201810733097.5 | 申请日： | 2018-07-05 |
| 公开（公告）号： | CN108929863B | 公开（公告）日： | 2019-11-22 |
| 发明（设计）人： | 宗鑫;汪以真;赵婧 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/867;C12R1/91 |
| 代理公司： | 33200 杭州求是专利事务所有限公司 | 代理人： | 林松海<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 310058 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 脂肪酸吸收 基因敲除 甲基转移酶基因 上皮细胞系 干扰载体 猪肠道 构建 耐受 基因 肠道上皮细胞 基因干扰 利用基因 新功能 猪源 转运 调控 研究 | ||
1.一种METTL3基因敲除的细胞系的构建方法，其特征在于，利用m6A甲基转移酶基因Mettl3在通过基因敲除方法获得耐受LPS刺激导致脂肪酸吸收障碍的猪肠道上皮细胞系；
包括以下步骤：
1）根据所述的m6A甲基转移酶基因Mettl3设计shRNA，
所述的Mettl3序列如SEQ ID NO.1所示，所述的shRNA序列如SEQ ID NO.2，SEQ IDNO.3所示；
2）针对m6A甲基转移酶基因Mettl3 shRNA进行磷酸化；
3）将磷酸化的Mettl3 shRNA连接到慢病毒表达载体获得Mettl3 shRNA慢病毒表达载体；
4）以293A细胞作为受体，将步骤3）获得的Mettl3 shRNA慢病毒表达载体进行慢病毒包被；
5）将步骤4）获得的Mettl3 shRNA慢病毒侵染肠道上皮细胞，利用嘌呤霉素进行筛选，获得基因编辑敲除m6A甲基转移酶基因Mettl3的肠道上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述的Mettl3 shRNA慢病毒表达载体的构建方法具体如下：对shRNA慢病毒表达载体利用BbsI进行酶切，并进行胶回收获得线性载体；以步骤2）获得磷酸化的Mettl3 shRNA，采用T4连接酶，连接到pRSI9-U6慢病毒表达载体。
3.一种根据权利要求1所述的建立方法得到的耐受LPS刺激导致脂肪酸吸收障碍的猪肠道上皮细胞系。
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