[发明专利]mir-124和HER2-shRNA双基因表达盒病毒载体、构建方法、病毒、应用

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及mir124和HER2‑shRNA双基因表达盒病毒载体、构建方法、病毒、应用。该双基因表达盒病毒载体包括在病毒表达载体中整合连接mir‑124序列和HER2‑shRNA序列构建而成；其中mir‑124序列如SEQ ID NO.1所示，HER2‑shRNA序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。对乳腺癌细胞转染率高达80％～90％，在乳腺癌细胞中能够高效稳定地表达mir‑124和HER2‑shRNA，发挥协同增效作用，能够显著的抑制乳腺癌细胞的增殖并促进凋亡，可用于乳腺癌、卵巢癌等HER2阳性肿瘤的基因治疗。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及mir1-24和HER2-shRNA双基因表达盒病毒载体、构建方法、病毒、应用。

背景技术

乳腺癌是全世界女性最常见的肿瘤，在我国其发生率占全身恶性肿瘤的7％～10％，且发病年龄有年轻化倾向。虽然通过早期筛查和诊断，乳腺癌死亡率正逐年下降，但发病率仍居女性肿瘤发生的首位，严重威胁着女性健康。目前治疗乳腺癌的主要方法有手术治疗、化疗、放疗、内分泌治疗等。化疗是浸润性乳腺癌的主要疗法，但是经过治疗后乳腺癌患者仍有复发转移的危险。迄今为止，复发转移性乳腺癌仍是不能被治愈的疾病，其5年总生存率仍不足25％。

随着生物技术的进步，临床靶向治疗有了很大的进展，分子靶向治疗也已成为乳腺癌治疗的有效手段之一。人表皮生长因子受体2(HER2)是一种原癌基因，定位于人类染色体17q21-22，编码p185蛋白，是表皮生长因子受体家族(EGFR)的第二成员，与EGFR家族其他成员及其配体之间相互作用，转导细胞增生信号，调节细胞的生长、生存、分化和增殖。正常情况下处于非激活状态，内外界因素的刺激可使其结构或表达失常，激活转化为癌基因，表现为HER2基因扩增或编码受体蛋白的过度表达，HER2基因扩增与细胞增殖和迁移、肿瘤的侵袭和转移、血管生成以及细胞的凋亡减少有关。HER2在大约22％的早期乳腺癌和35％的局部晚期和转移性乳腺癌患者以及40％的炎性乳腺癌患者中存在着扩增或蛋白的过度表达，与乳腺癌的进展和不良预后密切相关，是乳腺癌靶向治疗的明确靶点。目前也研究开发出一些靶向药物，但是这些靶向药物存在对患者心脏毒性负担重，价格昂贵等缺陷，在临床应用上存在很多局限性。

干扰RNA技术是一种新兴的转录后基因沉默技术，指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。它通过21-23nt的dsRNA或发夹状RNA与特异性mRNA结合，导致靶基因的降解，进而下调目的产物的表达，不会产生全身毒性反应等传统治疗方法的局限性。RNA干扰技术具有简单迅速、特异、高效、经济等优点，已经被广泛用于探索基因功能和恶性肿瘤的基因治疗的领域。现有技术中为了克服传统HER2靶向药的缺陷，研究应用不同种类的siRNA沉默乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌、非小细胞肺癌等细胞中HER2基因，证实可以显著下调HER2mRNA和HER2蛋白的水平，特异性地抑制肿瘤细胞的增殖，而且也进一步为了提高siRNA在细胞内的稳定性，研究出了病毒介导的HER2-shRNA载体，能够成功的转染目标细胞，实现对目标细胞的抑制生长增殖作用。然而目前研究出的HER2-shRNA病毒载体转染乳腺癌、卵巢癌等HER2高表达的细胞后对细胞的抑制增殖效果仍然不能满足实际的需求，需要对该病毒载体做进一步的研究以提高其对目标细胞的抑制增殖作用。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一是提供mir-124和HER2-shRNA双基因表达盒病毒载体，转染效率高，能够高效的将mir-124和HER2-shRNA整合到目标细胞的基因组中，在目标细胞中同时表达mir-124和HER2-shRNA，更显著地抑制乳腺癌细胞的增殖并促进其凋亡。

本发明的目的之二是提供mir-124和HER2-shRNA双基因表达盒病毒载体的构建方法。

本发明的目的之三是提供由本发明双基因表达盒病毒载体构建得到的病毒。