[发明专利]一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法

说明书

一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，涉及一种转入了人血清白蛋白基因的柱花草的制备方法，以及从该转基因柱花草中表达的人血清白蛋白。目的是以基因重组人血清白蛋白在柱花草中的表达作为从人血清中提取分离血清白蛋白的替代方法，解决其来源有限且价格昂贵的问题。方法：一、以柱花草无菌苗真叶为外植体诱导形成愈伤组织；二、农杆菌菌液的活化与重悬；三、用农杆菌重悬液对胚性脆性愈伤组织进行转染；四、将转染后的愈伤组织转入共培养基上共培养；五、将愈伤组织移入筛选分化培养基中筛选培养，诱导抗性植物再生，鉴定为阳性的即为转基因柱花草。本发明用于获得可表达基因重组人血清白蛋白的转基因柱花草以及从中表达人血清白蛋白。

技术邻域

本发明涉及转基因柱花草的制备，并用该转基因柱花草表达人血清白蛋白。

技术背景

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是人血浆中主要的蛋白质，约占血浆总蛋白的60％，由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66.5kD，等电点在4.7～4.9之间。HSA的主要生理功能在于维持血液胶体渗透压；结合并运输内源性及外源性物质，其中包括脂肪酸、胆色素、激素、生物学活性物质及药物等；临床上用于烧伤和严重失血等引起的休克、急性缺血性脑卒中、肾病综合症、肝硬化、肺性脑病、糖尿病性肾病和皮肤溃烂，也可作为血浆增容剂。血浆白蛋白每下降2.5g/L，死亡危险性增加24％～56％；当血浆白蛋白水平<20g/L，患者死亡率几乎是100％。在制药领域，HSA广泛用作保护剂、稳定剂和赋形剂等。目前，HSA全球年市场需求量超过600吨。临床使用的HSA 主要通过人体血液提取，受人血来源不足和血源传染病的影响，供应相对紧张。因此，重组人血清白蛋白的生产作为一种获得大量无病原HSA的替代方法越来越受到重视。

由于临床上HSA的使用剂量为每日5～10g，现有微生物表达系统的生产规模无法满足需要，转基因动物制备的基因重组HSA传播疾病的潜在风险。到目前为止，利用酵母和转基因水稻等制备的基因重组HSA主要用做培养基或者制剂辅料，仍然不能满足临床用药需求。

发明内容

本发明是针对现有原核或真核生物为生物反应器的表达量低、无生物活性或不安全等特点，为解决目前人血白蛋白来源有限及价格昂贵的问题，提供一种表达基因重组人血白蛋白的转基因柱花草的制备方法，并从中表达人血清白蛋白。

本发明用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，按以下步骤进行：

一、选择籽粒饱满的柱花草种子去除褐色种皮后进行消毒处理，将去皮的种子于80℃热水预处理5min，75％的乙醇消毒1～2min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v)次氯酸钠溶液消毒5～15min，无菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于1/2MS培养基中，26℃暗培养2～3d后，移至节律光照培养至形成真叶；

二、剪取柱花草无菌苗的真叶，无菌条件将其切割为0.5～0.8mm的小段，接种于愈伤组织诱导培养基中，26℃暗培养；

三、将培养10～15d的外植体转入继代培养基，每两周继代一次，培养至形成胚性脆性的愈伤组织；

四、将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素 50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃，180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50～1:100接种到100mL含AS 100μM的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至 OD₆₀₀达0.6～0.8，获得活化菌液；