[发明专利]一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法

权利要求书

1.一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于人血清白蛋白由转入了人血清白蛋白基因的转基因柱花草中表达；

2.表达人血清白蛋白的转基因柱花草的制备按以下步骤进行：

一、选择籽粒饱满的柱花草种子，去除褐色种皮后进行消毒处理，将去皮的种子于80℃热水预处理5min，75％的乙醇消毒1～2min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v)次氯酸钠溶液消毒10～15min，无菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于1/2MS培养基中，26℃暗培养2～3d后，将萌发的种子移至节律光照培养至形成真叶；

二、剪取柱花草无菌苗的真叶，无菌条件将其切割为约0.5～0.8mm的小段，接种于愈伤组织诱导培养基中，26℃暗培养；

三、将培养10～15d的外植体转入继代培养基，每两周继代一次，培养至形成胚性脆性的愈伤组织；

四、将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃，180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50～1:100接种到100mL含乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)100μM的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD₆₀₀达0.6～0.8，获得活化菌液；

五、取活化后的菌液3500g离心5～10min收集菌体，将菌体用愈伤组织诱导培养基重悬至OD₆₀₀为0.5～0.6，将步骤三中培养的胚性愈伤组织分离为直径约0.5mm的小块，置于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡5～10min，然后取出愈伤组织于无菌滤纸上吸干表面菌液，转入共培养基中，于26℃黑暗条件下共培养2～3d；

六、将共培养3d后的愈伤组织用含300mg/L头孢噻肟钠(Cefotaxime sodium)的MS培养基清洗1次，用无菌滤纸吸干表面多余培养基后，转入愈伤组织诱导培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次至愈伤组织形成胚状体；

七、将形成胚状体的抗性愈伤组织转移至不定芽分化培养基中，26℃光照节律条件下培养，2周继代一次至分化出不定芽；

八、将分化出的不定芽从愈伤组织上分离，转接至生根培养基中培养，待再生植株形成后炼苗、移栽，并对再生植株进行鉴定，获得阳性植株即为转基因柱花草。

3.根据权利要求2所述的一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于步骤二中的愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基附加4.0mg/L 6-BA，1.0mg/LNAA。

4.根据权利要求2所述的一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于步骤三中的愈伤组织继代培养基为MS基本培养基附加4.0mg/L 6-BA，1.0mg/LNAA。

5.根据权利要求2所述的一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于步骤五中共培养基为MS基本培养基附加4.0mg/L 6-BA，1.0mg/L NAA，乙酰丁香酮100μM。

6.根据权利要求2所述的一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于步骤六中的筛选分化培养基为MS基本培养基附加4.0mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，2mg/L酪蛋白水解物，25mg/L潮霉素和300mg/L头孢噻肟钠。

7.根据权利要求2所述的一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于步骤六中的培养条件为：温度24～26℃，光周期为16小时光/8小时暗，光照强度1600Lx。

8.根据权利要求2所述的一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于步骤七中的不定芽分化培养基为MS基本培养基附加4.0mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，25mg/L潮霉素和300mg/L头孢噻肟钠。