[发明专利]一种猪细小病毒的增殖方法

说明书

本发明涉及一种猪细小病毒的增殖方法，将猪细小病毒接种于ST细胞，进行细胞培养至90%~100%细胞出现病变；反复冻融使宿主细胞破碎，离心去除细胞碎片，收集上清液；将上清液、牛血清白蛋白、甘露醇和/或甘氨酸、L‑精氨酸混匀，然后进行冷冻干燥；其中，牛血清白蛋白（BSA）占混合液总质量的1~2%，甘露醇和/或甘氨酸占混合液总质量的1~3%，L‑精氨酸占混合液总质量的0.5~3%。本发明提供的猪细小病毒的增殖方法，工艺简便、传代次数少，在病毒去除/灭活验证具有广泛应用前景。增殖后的病毒滴度不低于10^6.0 TCID₅₀/0.1ml，显著高于现行技术培养的猪细小病毒的滴度。

技术领域

本发明属于微生物应用领域病毒培养技术，具体涉及一种猪细小病毒的增殖方法。

背景技术

培养基是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，合成培养基中一般含有必需氨基酸，这些对细胞生长、病毒增殖都有影响。氨基酸作为一类能够提高病毒滴度的物质，在相同的培养条件下，添加少量氨基酸即可获得更高滴度的病毒。

冷冻干燥或“冻干”是用于去除水分的技术方法。其中，含水溶液在其共晶点以下被冷却，直至其完全被冷冻。之后，将大气压降至真空，使得水升华并从溶液中脱出。被溶解的因子保持为多孔固体，之后其可再次溶于水。因此冷冻干燥也可以作为浓缩的一种手段。

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属(Parvovirus)，是引起母猪繁殖障碍疾病的主要病原之一，可导致母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎、弱仔及母猪不育和新生仔猪大量死亡。PPV对热具有较强抵抗力，56℃48小时、70℃2小时病毒的感染性和血凝性均无明显改变；对酸碱有较强的抵抗力，在pH3.0～9.0之间稳定；能抵抗乙醚、氯仿等脂溶剂；甲醛蒸气和紫外线需要相当长的时间才能杀死该病毒。

PPV作为一类无包膜、单股DNA基因组和强抵抗力的病毒，在血液制品、生物制品和动物源性医疗器械的病毒去除/灭活验证中，具有广泛的应用。

在病毒去除/灭活验证中，指示病毒的滴度需达到10⁶TCID₅₀以上，但猪细小病毒在不同的细胞上增殖效果不尽相同，出现病变的时间、病变特征、病变观察的难易程度、病毒含量和血凝价均有所差别，如不能掌握其规律选择最佳的细胞系进行病毒的培养及培养技术，将很难培养出高的的滴度。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种猪细小病毒的增殖方法，培养出的病毒滴度高。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种猪细小病毒的增殖方法，包括如下步骤：

(1)将猪细小病毒接种于ST细胞，进行细胞培养至90％～100％细胞出现病变；

(2)反复冻融使宿主细胞破碎，离心去除细胞碎片，收集上清液；

(3)将所述的上清液、牛血清白蛋白、甘露醇和/或甘氨酸、L-精氨酸混匀得到混合液，然后将所述的混合液进行冷冻干燥；其中，所述的牛血清白蛋白(BSA)占所述的混合液总质量的1～2％，所述的甘露醇和/或甘氨酸占所述的混合液总质量的1～3％，所述的L-精氨酸占所述的混合液总质量的0.5～3％。

优选地，所述的牛血清白蛋白占所述的混合液总质量的1.5～2％。

优选地，所述的甘露醇和/或甘氨酸占所述的混合液总质量的2.5～3％。

优选地，所述的L-精氨酸占所述的混合液总质量的2.5～3％。

优选地，所述的增殖方法还包括将冷冻干燥后的病毒用含1～3wt％胎牛血清的MEM培养基复溶至所述的上清液体积的5～15％的步骤。