[发明专利]一种基于蛋白质错误折叠的用于抗氧化药物筛选的细胞模型的构建方法

说明书

本发明属细胞生物学领域，针对蛋白质错折叠目前无法在活体细胞内实时定量评估的缺陷，提供一种基于蛋白质错误折叠的用于抗氧化药物筛选的细胞模型的构建方法。构建荧光蛋白标记的野生和突变报告基因COMP基因慢病毒载体，在人胚肾293T细胞中包装病毒，转导HeLa细胞，嘌呤霉素筛选获得稳定表达COMP蛋白的细胞模型。建立一个具有国际水平、自主创新的药物筛选细胞模型，不仅能为今后的蛋白质错折叠药物筛选产业化研究提供关键参数，为解决重大疾病的可持续性研究提供相关科学依据。细胞模型具有高染色体整合度、高荧光强度、遗传性状稳定且对抗氧化药物敏感的特点，是一种理想的研究蛋白质错误折叠药物筛选的模型。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种基于蛋白质错误折叠的用于抗氧化药物筛选的细胞模型的构建方法。

背景技术

蛋白质是生物体内一切功能的执行者。人体内的任何功能，从催化化学反应到抵御外来侵略都是蛋白质作用的结果。蛋白必须精确折叠成为正确的三维结构，才能在人类细胞中执行功能。近年发现蛋白质的错误折叠可以导致一些疾病。蛋白质的错误折叠与疾病的关系已成为分子生物学新的研究前沿。构建一种简单、安全、高效的药物筛选细胞模型是解决当前国际上流行的神经退行性疾病如阿尔兹海默症、帕金森病及遗传性骨病、苯丙酮尿症等蛋白质错折叠疾病防治的瓶颈与难点。

在药物筛选过程中，药筛模型的模型构建是最初的也是最重要的一个环节，对于新药发现的效率和效果起着至关重要的作用。高通量筛选(high-throughput screening ,HTS), 是在组合化学、基因组学、药理学等学科推动下出现的一项高效率大规模药物筛选技术。HTS 主要分为基于单纯靶标(靶蛋白得到分离纯化,在细胞外环境下进行)的筛选和基于细胞模型的筛选。基于单纯靶标(细胞外)的筛选必须在确切知道作用靶标并且作用靶蛋白能分离纯化的条件下才能进行, 在此模型上进行的药物筛选作用机制明确, 靶标单一。基于细胞的筛选是在细胞模型上进行, 特别适用于功能蛋白难以分离、生化分析不能完成的复杂靶标，基于细胞模型的高通量筛选是今后高通量筛选的主要筛选模型。

多发性骨骺发育不良（MED）是一种的罕见的遗传性软骨发育不良疾病，由于软骨细胞外基质蛋白（例如，软骨寡聚基质蛋白；COMP）及细胞膜转运蛋白等的缺陷所造成的全身性骨骼发育异常，属于蛋白质的错误折叠所引起的疾病之一。正常人体内的COMP蛋白会分泌到细胞外，行使正常的功能，而对于MED患者，COMP基因发生突变，突变的COMP蛋白沉积在软骨细胞的粗面内质网上，使错误折叠的蛋白在内质网上大量堆积，不能正常分泌和转运，引发内质网应激反应，最终导致软骨细胞的凋亡和细胞的增殖速率降低，从而诱发疾病的发生。

目前的研究发现，在COMP^D469del突变的小鼠模型中，抗氧化剂和抗炎症药物能有效减少软骨细胞的上COMP蛋白的积累，尤其是乙酰水杨酸（阿司匹林）和白藜芦醇药物，从而营救了突变小鼠的骨骼发育异常，该突变的小鼠模型会导致严重的假性软骨发育不全（PSACH），但对于研究COMP突变导致的MED疾病还存在一定的局限性。

发明内容

本发明针对蛋白质错折叠目前无法在活体细胞内实时定量评估的缺陷，提供了一种基于蛋白质错误折叠的用于抗氧化药物筛选的细胞模型的构建方法。

本发明由如下技术方案实现的：一种基于蛋白质错误折叠的用于抗氧化药物筛选的细胞模型的构建方法，采用分子生物学基因重组技术构建荧光蛋白标记的野生和突变报告基因COMP基因慢病毒载体，在人胚肾293T细胞中包装病毒，转导HeLa细胞，嘌呤霉素筛选获得稳定表达COMP蛋白的细胞模型。

具体步骤如下：

（1）用携带抗生素抗性基因、报告基因、目的基因的慢病毒载体转染人胚肾293T细胞，获得抗性基因和报告基因的慢病毒颗粒；