[发明专利]一种合成次黄嘌呤的重组菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种合成次黄嘌呤的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。该重组菌是以大肠杆菌为出发菌株，分别敲除大肠杆菌基因组上的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和次黄苷酸脱氢酶基因guaB，并且过表达D128A突变的PRPP合成酶基因prs和K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF。同时，本发明还提供了该重组菌的制备方法及利用该重组菌的生产次黄嘌呤的方法。本发明首次实现了工程大肠杆菌中次黄嘌呤的高效生物合成。该重组菌适用于发酵生产次黄嘌呤。

技术领域

本发明涉及一种合成次黄嘌呤的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

嘌呤是一类重要的生命活性物质，参与细胞体内遗传信息物质的合成。嘌呤生物合成过程的中间代谢物对于细胞生命过程的遗传物质传递、信号运输和能量代谢等方面起到重要作用。另外，嘌呤及其衍生类化合物在医药领域也具有广泛的应用，例如疾病的诊断和治疗以及生命科学等研究领域，进而引发了人们对合成嘌呤及衍生物的浓厚兴趣。目前，以嘌呤为骨架的衍生物已广泛应用于药物研究，例如嘌呤类化合物可诱导干扰素释放，可作为促肾上腺皮质激素受体的配体，或者是腺苷受体激动剂拮抗剂，还可通过抑制多种功能性酶类发挥生物学功能。嘌呤类化合物在抗肿瘤药物的研究中也有较长的历史，例如早期的巯基嘌呤类药物，后来发现了奈拉滨、氟达拉滨、克罗拉滨等嘌呤类核苷药物用于癌症的治疗。

目前嘌呤类化合物的生产菌株主要利用诱变筛选技术获得，但往往耗时长、效率低、而且获得的菌株存在不稳定的缺陷。近年来，随着菌株代谢调控机理和生理生化方法的研究、利用代谢工程技术获得嘌呤化合物的合成菌株引起了研究人员的关注。虽然细胞内嘌呤的生物合成路线早已探明，然而其合成路线较长、并受到细胞内多层次、不同水平的严密调控，自然状态下难以实现嘌呤的积累。目前研究人员仅在棒状杆菌中(Corynebacterium glutamicum)实现了次黄嘌呤的微摩尔水平合成，难以满足嘌呤化合物大量生物合成的需求。大肠杆菌因其培养成本低、生长速度快、基因操作简便，是微生物合成领域的首选宿主之一，然而目前暂无工程大肠杆菌制备次黄嘌呤的报道。因此，通过对嘌呤合成途径的调控，利用代谢工程技术建立高效合成嘌呤的工程大肠杆菌具有重要的科研和应用价值。

发明内容

为实现利用生物法大量合成次黄嘌呤，本发明提供了一种合成次黄嘌呤的工程大肠杆菌、该菌株的制备方法以及利用该工程大肠杆菌生产次黄嘌呤的方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种合成次黄嘌呤的重组菌，该重组菌是以大肠杆菌为出发菌株，分别敲除大肠杆菌基因组上的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和次黄苷酸脱氢酶基因guaB，并且过表达D128A突变的PRPP合成酶基因prs和K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF。

优选地，所述转录阻遏蛋白基因purR的Gene ID为945226；所述磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd的Gene ID为946362；所述腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA的Gene ID为948695；所述次黄苷酸脱氢酶基因guaB的Gene ID为946985；所述D128A突变的PRPP合成酶基因prs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，以大肠杆菌W3110为出发菌株。

本发明还提供了一种上述任一所述重组菌的构建方法，包括如下步骤：