[发明专利]一种用于检测金黄色葡萄球菌活性的荧光RAA引物、探针及检测方法

说明书

本发明提供了一种用于检测粪便样品中金黄色葡萄球菌活性的荧光RAA引物和探针及检测方法，该荧光RAA引物和荧光探针可以快速、定性检测粪便样本中的金黄色葡萄球菌活性，能在39℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间；该荧光RAA引物和荧光探针特异性更强、灵敏度更高，完全满足疫情快速诊断和全程监控，为疫情早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，具体涉及一种用于检测粪便样品中金黄色葡萄球菌活性的荧光RAA引物和探针及检测方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一，在自然界中广泛存在，尤其是肉及肉制品、乳及乳制品等主要的食品类别中，属于革兰氏阳性菌，直径为0.8～1.5微米，无鞭毛、芽孢，少数有荚膜，不能运动，为需氧或兼性厌氧菌。最适宜的生长温度为37℃，pH值为7.4。金黄色葡萄球菌具有高度的耐盐性，可以分解乳糖、麦芽糖、蔗糖、核糖、松二糖、甘露糖产酸不产气，在1884年首次被发现，Rosenbach在固体培养基上培养出葡萄球菌，并在同年记录了它能引起食物中毒。

金黄色葡萄球菌自身细胞膜相对致密，存活率相对较高，同时，产生的金黄色葡萄球菌肠毒素种类繁多、致病性强，且易溶于水、盐溶液，能够耐受胃液中的蛋白酶，100℃30min内仍可存活。有资料报道，在每100g食物中含有不足18μg的肠毒素便能引起金黄色葡萄球菌中毒症状。该肠毒素是由血浆凝固酶或耐热酸酶阳性菌株所产生的一类结构相关、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质，经过血清学鉴定包括14种，常见的有SEA、SEB、SEC、SED、SEE。同时金黄色葡萄球菌还能产生α、β、γ、δ四种溶血毒素，这些溶血毒素可以导致血小板和溶酶体损伤，有的毒素还可以导致白细胞和巨噬细胞的损坏，有的可以导致血液中纤维蛋白的沉积。其分泌的葡萄球菌肠毒素可引起人类胃肠炎性等多种疾病。据报道，每100克食物中含18微克葡萄球菌肠毒素时即可引起金黄色葡萄球菌食物中毒。根据美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。

传统的检测方法检测周期长，且分离阳性率低，往往会延误病程和疫情的控制。分子生物学诊断方法可以在症状时期检测到细菌的感染，并且快速灵敏，目前已被广泛的应用于金黄色葡萄球菌的检测。目前，国内外已建立的金黄色葡萄球菌检测方法有实时PCR检测方法、半巢式PCR检测方法、LAMP检测方法等，但PCR方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，而LAMP方法引物较复杂，必须用特殊的软件设计，且用LAMP方法得到的扩增产物是一些大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判断目的基因的存在。

发明内容

本发明目的是提供一种用于重组酶介导核酸扩增技术检测金黄色葡萄球菌活性的荧光RAA引物和荧光探针以及使用该荧光RAA引物和荧光探针对金黄色葡萄球菌活性的检测方法，该检测方法可以快速、定性检测粪便样本中的金黄色葡萄球菌活性。

本发明的一个目的是提供一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物对，所述引物对包括下述1)-3)中的至少一种：

1)序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列和序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；和在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)、或2)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。

具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。

上述高严谨条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。