[发明专利]检测百合南芥菜花叶病毒的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种特异性检测百合南芥菜花叶病毒ArMV的IC-RT-LAMP试剂盒，包括特异性ArMV抗体IgG、特异性RT反向引物ArMV-R、特异性LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂和LAMP扩增反应试剂，所述特异性LAMP引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP和正向环引物LF，所述特异性RT反向引物ArMV-R以及LAMP引物组的序列如下：

ArMV-R：5’- AATCATTAGGGAAAGTCG-3’

F3：5’- ACAAAAGTGTGTCCCTTCT-3’

B3：5’- AAACAGTTGATTCCAGTTGTT-3’

FIP：5’- ACCAACACCAAGATAGTAACTCAAATTTGGGCCAAACTCTTGTT-3’

BIP：5’- TGGTCAAGGGCAAAGTGCATATGACCCCATTCCATTCAC-3’

LF：5’- ATGTAGCCCTTGTACTTATGGCA -3’

其特征在于：所述试剂盒还包括ArMV抗体IgG 包被缓冲液（CB）、磷酸缓冲液（PBS）、磷酸洗涤缓冲液（PBST）、SYBR Green I荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品，所述阴性对照品为ddH₂O；所述阳性对照品为切花百合ArMV CP基因标准品；所述阳性对照品序列如下：

切花百合ArMV CP基因标准品：

TACTACCAGTGCCTACAAAAGTGTGTCCCTTCTTTTGGGCCAAACTCTTGTTGATGGGACTCATAAAGTGTATAATTATAATAATACACTTTTGAGTTACTATCTTGGTGTTGGTGGTGTGGTCAAGGGCAAAGTGCATATATGTAGCCCTTGTACTTATGGCATAGTCCTAAGAGTTGTTAGTGAATGGAATGGGGTCACTAACAACTGGAATCAACTGTTTAAATACCCCGGGTGTTATATCGATGAGGATGGGAATTTTGAAATTGAAATTCGTTCCCCATATCATCGAACTCCACTGCGCTTACTGGATGGACAGGCAGCGAGCTCTTTCACGAGCACGCTGAATTTCTATGCAATTTCGGGGCCAATTGCCCCGAGTGGAGAAACTGCTAAGATGCCAGTGGTAGTGCAAATTGACGAAATTGCATTACCAGATCTTTCCGTCCCGACTTTCCCTAATGATT。

2.一种采用如权利要求1所述的特异性检测百合南芥菜花叶病毒的IC-RT-LAMP试剂盒特异性检测百合南芥菜花叶病毒的检测方法，其特征在于：

①抗体制备：制备ArMV病毒CP的基因工程重组蛋白，用其免疫动物，获得特异性的ArMV抗体IgG；

②免疫捕获IC：将步骤①获得的特异性的ArMV抗体IgG包被在反应容器中，特异捕获待测样品中的ArMV粒子；

③反转录RT：以步骤②捕获的ArMV粒子为模板，利用ArMV的特异性RT反向引物ArMV-R和第一链cDNA合成试剂进行反转录RT反应，以此获得第一链cDNA；

④LAMP扩增：以步骤③得到的第一链cDNA作为模板，用LAMP特异性引物组和LAMP扩增反应试剂进行LAMP扩增，并以ddH₂O作为阴性对照，以切花百合ArMV CP基因标准品作为阳性对照；

⑤分析判断反应产物：以步骤④中所得LAMP扩增结果判断待测样品中是否含有ArMV。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤①所述ArMV抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤⑤中根据扩增结果判断待测样品中是否含有ArMV的具体方法为荧光染料肉眼观察法；所述荧光染料肉眼观察法为：取SYBRGreen I 荧光染料反应液加入步骤④所述LAMP扩增的反应产物中，采用肉眼直接观察，若扩增产物出现绿色，说明SYBR Green I染料与双链DNA 结合，则为阳性反应，表示样品中含有ArMV；若扩增产物颜色为橙色则为阴性反应，表示样品中不含ArMV。

5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤⑤中根据扩增结果判断待测样品中是否含有ArMV的具体方法为琼脂糖凝胶电泳检测技术；所述琼脂糖凝胶电泳检测技术为：将步骤④所述LAMP扩增的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物呈明亮的弥散状核酸泳带，则为阳性反应，表示样品中含有ArMV；若扩增产物无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含ArMV。