[发明专利]一种Hemi-M甲基化修饰引物及其应用

说明书

本发明提供了一种Hemi‑M甲基化修饰引物及其应用，所述引物至少含有一个被甲基化修饰的胞嘧啶，其中，所述甲基化修饰包括甲基化和/或羟甲基化修饰；本发明通过设计特异性的甲基化修饰引物，巧妙地与dCTP被mdCTP替代的dNTP相结合，对样本DNA进行胞嘧啶保护，创造性地将其应用于甲基化文库的构建，辅佐以特定的标签，适用于多种应用领域和场景，从而解决文库DNA自身对比分析的问题，实现更准确的甲基化位点分析，具备广阔的应用前景和巨大的市场价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种Hemi-M甲基化修饰引物及其应用。

背景技术

在表观遗传学中，甲基化是目前研究中相对较为深刻的。DNA的甲基化水平可以决定一个或者一类基因的表达或者抑制，对于细胞功能正常与否有着重要作用，进而影响人类的生命进程。所以，甲基化研究是表观遗传学研究的热门领域之一。基因组DNA水平的甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下，以硫腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将一个甲基添加到胞嘧啶5’-碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶，原理如图1所示。

CpG岛(CpG island)是富含CpG二核苷酸的一些区域，长度为300—3000bp，CpG是胞嘧啶(C)—磷酸(p)—鸟嘌呤(G)的缩写，位于转录起始位点上游的启动子区域，看家基因的启动子CpG岛保持非甲基化状态，以保证看家基因的正常表达。组织特异性基因的CpG相对较少，并且在大多数组织中都处于甲基化状态。当启动子区域的CpG被甲基化时，转录受到抑制，该区域的CpG甲基化密度与转录抑制的程度有关。肿瘤组织中存在着基因组普遍低甲基化和局部区域过甲基化。抑癌基因启动子区域CpG岛过甲基化是许多肿瘤发生的早期重要事件，抑癌基因启动子区域CpG岛过甲基化可致使相关基因表达下调，甚至不表达，从而影响细胞内及细胞间正常生长凋亡。原癌基因的低甲基化，可以引起原癌基因的转录激活，同时也能影响临近基因的正常表达。DNA的去甲基化破坏基因组印记，增加了患癌风险。

目前的甲基化研究方法中，主要包含：甲基化特异性PCR、重亚硫酸盐测序法、高分辨率溶解曲线法、基因组直接测序法等。最常用的方法是重亚硫酸盐的方法。该方法中，在重亚硫酸盐的作用下，DNA中未被甲基化修饰的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，通过高通量测序检测出未被转化的胞嘧啶(C)，即为被甲基化修饰。

CN105002567A提供了一种无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的构建方法，对样品基因组酶切和加A，获得5’末端具有磷酸化修饰和3’粘性末端A的DNA片段，将其与含有不同条形码序列的甲基化接头相连；连接产物分为两组，一组进行PCR扩增，另一组经重亚硫酸盐转化后再扩增，获得两组含有相同条形码、仅在无甲基化的胞嘧啶位点不同的扩增产物序列；两组PCR产物分别混合，选择相同的特定长度片段序列进行低循环PCR，扩增产物分别分离纯化构建高通量简化甲基化测序文库。该方法通量高、成本低、序列一致，无需参考基因组，在大量无参考基因组或参考基因组组装不全物种的DNA甲基化表观遗传学研究领域应用前景广阔。CN104532360A提供了一种全基因组甲基化测序文库及其构建方法。该构建方法包括以下步骤：S1，对全基因组DNA进行片段化，得到DNA片段；S2，采用由dATP、dTTP和dGTP混合形成的dNTP对DNA片段进行末端修复，得到修复片段；S3，对修复片段进行3’末端加“A”，得到3’末端带“A”片段；S4，采用经过“C”到“T”转化处理的接头序列对3’末端带“A”片段进行接头连接，得到带接头片段；S5，对带接头片段进行“C”到“T”转化处理，得到处理片段；S6，对处理片段进行扩增，得到全基因组甲基化测序文库，通过采用不含dCTP的dNTP进行末端修复，避免了非甲基化C的引入，提高了甲基化程度分析的准确性。

但是，目前的研究中，只能将序列比对到基因组上，才能得知甲基化位点。还没有一种方法可以是自身作为对照进行甲基化位点定位分析。因此，提供一种甲基化修饰引物并用于以自身为对照进行甲基化位点分析，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容