[发明专利]一种Hemi-M甲基化修饰引物及其应用

权利要求书

1.一种对DNA样品进行胞嘧啶保护的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Hemi-M甲基化修饰引物，所述引物中的胞嘧啶均被甲基化；

其中，所述甲基化修饰包括甲基化和/或羟甲基化修饰；

所述试剂盒还包括dNTP，所述dNTP中的dCTP被mdCTP替代。

2.一种PCR方法，其特征在于，所述方法为：采用权利要求1所述的试剂盒进行PCR扩增反应，对样本DNA链进行胞嘧啶保护；

其中，所述PCR扩增的dNTP中的dCTP被mdCTP替代。

3.根据权利要求2所述的PCR方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应循环数为1-3个循环。

4.一种以非疾病诊断为目的的甲基化文库的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将DNA样品进行末端修复，3’端加A，甲基化接头连接；

(2)将步骤(1)处理后的产物采用权利要求1所述的试剂盒进行胞嘧啶保护；

(3)将步骤(2)处理后的产物进行重亚硫酸盐处理；

(4)将步骤(3)处理后的产物进行扩增添加索引序列，得到所述甲基化文库；

所述胞嘧啶保护为：

采用SEQ ID NO.1所示的引物对DNA样本链进行PCR扩增反应，且PCR扩增的dNTP中的dCTP被mdCTP替代，PCR扩增的反应循环数为1-3个循环。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的DNA样品为gDNA，所述方法还包括对DNA样品进行片段化处理的步骤。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)之前还包括引入标签的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述标签的结构为反向互补，正链3’端突出，5’端未被磷酸化，负链5’端被磷酸化。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述3’端突出为悬突胸腺嘧啶。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述标签含有鸟嘌呤和胞嘧啶，且与甲基化修饰引物结合于同一条DNA链上，且标签序列中所有的胞嘧啶全部被甲基化修饰；

其中，引入所述标签的方法为：将所述标签引入到DNA片段两端。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述标签为一条寡核苷酸退火形成的茎环结构，且3’端突出，5’端磷酸化。

11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述标签为两条寡核苷酸退火形成两端或一端互补配对，且3’端突出，5’端磷酸化。

12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，引入所述标签的方法为：将所述标签引入到DNA片段两端，经过处理后形成5’端突出，延伸后形成两端为平末端带标签的DNA片段。