[发明专利]CRISPR-Cas9高效敲除原代T细胞基因的方法及其应用

说明书

本发明涉及CRISPR‑Cas9高效敲除原代T细胞基因的方法及其应用。本发明具体涉及一种提高CRISPR‑Cas9敲除原代T细胞基因的效率的方法，所述方法包括向T细胞递送Cas9mRNA和化学修饰的sgRNA。该方法可应用于各种CAR‑T细胞、TCR‑T细胞、TIL细胞的制备。

技术领域

本发明涉及细胞治疗领域，特别涉及CRISPR-Cas9高效敲除原代T细胞基因的方法及其应用。

背景技术

基因编辑T细胞的应用

(1)通用型CAR-T细胞治疗

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗技术是通过体外转导一个识别癌细胞的人工基因于人体T细胞上，使人T细胞具有特异杀伤肿瘤细胞的能力。CAR-T细胞治疗属于过继性免疫疗法(adoptive cell transfer,ACT)，它利用人体免疫细胞来对抗肿瘤，被称为“活体药物”。基因编辑在CAR-T细胞治疗中是一个非常热门的领域，究其原因在于CAR-T细胞治疗是一个非常具有潜力的抗癌疗法，已经在多种白血病治疗中取得了巨大成功。另外一点是基因编辑技术使得CAR-T细胞治疗具有更多的可变性。基因编辑CAR-T细胞本质上是一种在体外操作的基因疗法，不需要面对复杂困难的递送方式，更有可行性。目前基因编辑CAR-T细胞主要应用于通用型CAR-T细胞治疗上，具体应用有以下几点：

a.TCR基因敲除，避免GvHD，从而可用于异体移植。移植物抗宿主反应(graftversus host disease，GVHD)是由移植物中的特异性淋巴细胞识别宿主抗原而发生的一种反应。其产生的条件是移植物中包含T淋巴细胞及移植物与宿主的主要组织相容性抗原不一致。在骨髓移植中，GvHD是主要的障碍，其会杀伤宿主体内的细胞而导致多器官功能衰竭，进而引起其它并发症。在通用型CAR-T细胞治疗中，GvHD是最需要避免的一个问题，否则宿主有严重的副作用。TCR是T淋巴细胞识别靶细胞主要基因，敲除TCR基因可以避免异体T细胞对宿主细胞的攻击，所以异体移植的通用型CAR-T细胞必须将TCR基因敲除才能避免GvHD。通常只需要将TCR-α或TCR-β其中之一敲除就可以使TCR蛋白不展示在T细胞表面。

b.B2M、CIITA基因敲除，避免受体T细胞攻击，降低排异反应。不同的个体，其组织相容性抗原存在差异，从而导致了受体T细胞对移植物的攻击和排异。为解决这个问题，通常利用基因编辑的方法(如ZFN、TALEN或CRISPR-Cas9)将CAR-T细胞中的B2M基因敲除，从而使HLA-ABC蛋白无法在细胞表面展示，进而可以避免被受体T细胞攻击。也有一些研究者将CIITA基因一并敲除，来降低二类组织相容性抗原的表达。

c.PD-1、CTLA-4、LAG-3等免疫检查点基因敲除，提高通用型CAR-T疗效。PD-1、CTLA-4等免疫检查点是近年已经被证明非常有效的肿瘤免疫靶点，通过这些免疫检查点抗体来封闭肿瘤浸润T细胞(TIL细胞)从而激活已经“疲惫不堪”的TIL细胞。已经有临床研究证明直接体外敲除TIL细胞的PD-1基因可以激活TIL细胞并有效缓解肿瘤进展，也有研究证明敲除PD-1可以增强CAR-T细胞的体内和体外抗肿瘤疗效。

(2)艾滋病领域

基因编辑T细胞在艾滋病治疗领域研究较早，从ZFN基因编辑工具开始就已经开始尝试编辑T细胞基因组DNA。艾滋病病毒非常特异的侵染CD4T细胞，理论上通过编辑CD4T细胞有治疗艾滋病的潜力。其具体应用是：

a.CCR-5基因敲除，防止HIV病毒侵染CD4T细胞。CCR-5是表达于T细胞表面的一个受体蛋白，著名的“柏林病人”布朗正是移植CCR-5基因缺陷的骨髓才彻底治愈艾滋病。CCR-5在T细胞或者干细胞中敲除是艾滋病治疗非常前沿的一个方向。

(3)TCR-T领域