[发明专利]CRISPR-Cas9高效敲除原代T细胞基因的方法及其应用

权利要求书

1.一种提高CRISPR-Cas9敲除原代T细胞基因的效率的方法，所述方法包括向T细胞递送Cas9 mRNA和化学修饰的sgRNA，其中靶向TRAC基因的sgRNA如SEQ ID NO: 4的DNA序列所示，靶向B2M基因的sgRNA如SEQ ID NO: 5的DNA序列所示，其中所述化学修饰的sgRNA的5’和3’端各三个碱基同时进行2’-O-甲基化和3’硫代磷酸化修饰。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Cas9类型包括：SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9和cpf1。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述Cas9类型为SpCas9。

4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述SpCas9的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

5. 根据权利要求1所述方法，其中Cas9 mRNA采用如下方法获得：将Cas9基因克隆至质粒载体后，PCR扩增出5’端带有T7或SP6启动子的Cas9 DNA片段，并体外转录为Cas9 mRNA。

6. 根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述Cas9 mRNA含有入核信号。

7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述入核信号包括SV40 NLS和核质蛋白NLS，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3。

8. 根据权利要求1-5中任一项所述的方法，所述方法还包括激活T细胞，并且在T细胞激活后2-5天采用电穿孔方式将所述Cas9 mRNA和化学修饰的sgRNA同时导入激活的T细胞。

9. 根据权利要求8所述的方法，其中电转转导时Cas9 mRNA和化学修饰的sgRNA的质量比为1:1至10:1。

10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述Cas9 mRNA可以用Cas9 蛋白或者表达Cas9的质粒代替。

11.一种基因敲入方法，所述基因敲入方法包括使用根据权利要求1-10中任一项所述的方法进行敲除后应用修复模板。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述修复模板包括腺相关病毒、非整合型慢病毒、单链DNA、双链DNA或质粒DNA。

13.根据权利要求1-10中任一项所述的方法制备的细胞，所述细胞包括CAR-T细胞、TCR-T细胞和TIL细胞。

14.根据权利要求13所述的细胞在制备用于治疗白血病、实体肿瘤、I型糖尿病或自身免疫疾病的药物中的用途。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述自身免疫疾病是艾滋病。