[发明专利]一种提高重组大肠杆菌发酵生产L-丙氨酸能力的方法

说明书

本发明公开了一种提高重组大肠杆菌发酵生产L‑丙氨酸能力的方法。本发明提供了一种制备产L‑丙氨酸的目的菌的方法，包括如下步骤：1)将大肠杆菌E.coli XZ‑A45经过氮离子注入诱变，得到诱变筛选目的菌株；2)再将所述诱变筛选目的菌株在含有浓度递增的葡萄糖和浓度递增的L‑丙氨酸的发酵培养基中进行连续传代培养，得到目的菌。本发明将L‑丙氨酸重组工程菌XZ‑A45先经过低能离子注入诱变，筛选获得产量高、遗传性状稳定的突变菌株，再经过进化工程育种技术驯化选育，最后获得高产L‑丙氨酸的工业微生物菌种。

技术领域

本发明涉及微生物的选育方法，具体涉及一种提高重组大肠杆菌发酵生产L-丙氨酸能力的方法。

背景技术

L-丙氨酸(L-Alanine)，又名L-α-丙氨酸，是人体所需的20种氨基酸之一，在生物体内由甘氨酸的氨基转移至丙酮酸而成。丙氨酸是血中氮的优良运输工具，又是一种有效生糖氨基酸，具有重要的生理功能。L-丙氨酸是一种白色结晶粉末，有特殊甜味，易溶于水，在食品及医药工业领域具有广泛的用途。L-丙氨酸可以提高食品的营养价值，改善有机酸的酸味，用作氨基酸类营养药，同时L-丙氨酸也是制造维生素B6、合成氨基丙醇和其他有机化合物的重要原料。

近些年来，已经有多个报道称，利用基因工程手段在E.coli中实现了L-丙氨酸的合成。Smith等将来源于Bacillus sphaericus的alaD基因克隆于质粒载体上，并在E.coliALS929菌株中表达，该菌株经过48小时发酵后，能够生产88g/L的L-丙氨酸。周哲敏等将来源于Geobacillus stearothermophilus的alaD基因克隆于质粒载体上，在E.coli B100菌株中表达，在5L发酵罐中发酵26小时，可产生106g/L的L-丙氨酸。

在大规模生产过程中需要工业微生物菌种具有能抗多重压力的特性。但具有像多重压力抗性这一类复杂性状的工程菌株，很难通过以基因工程为基础的方法来直接获得，而进化工程育种技术在提高微生物的环境耐受性方面具有独到的优势。近年来，离子束作为一种新的诱变源，在微生物诱变育种方面因其独特的诱变机理和生物学效应而发展迅速。与传统诱变技术相比，低能离子注入诱变具有突变率较高，突变谱广，死亡率低，正突变率高，性状稳定等特点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备产L-丙氨酸的目的菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将大肠杆菌E.coli XZ-A45经过氮离子注入诱变，得到诱变筛选目的菌株；

2)再将所述诱变筛选目的菌株在含有浓度递增的葡萄糖和浓度递增的L-丙氨酸的发酵培养基中进行连续传代培养，得到目的菌。

上述方法中，所述氮离子注入诱变包括如下步骤：

1)-1、将所述大肠杆菌E.coli XZ-A45进行氮离子注入诱变，收集诱变后菌株；

1)-2、将所述诱变后菌株进行发酵培养，检测发酵产物中L-丙氨酸含量，选取产生L-丙氨酸的量高于所述大肠杆菌E.coli XZ-A45的10％以上的菌株作为初筛后的诱变菌种；

1)-3、将所述初筛后的诱变菌种进行再次发酵培养，检测发酵产物中L-丙氨酸含量，选取所有菌种中L-丙氨酸含量从高到低前五位的菌株，作为复筛后的诱变菌种。

上述方法中，所述氮离子注入诱变的氮离子注入条件为：注入能量为10-40keV，注入剂量为10-50×10¹⁴ions/cm²；