[发明专利]一种量子点纳米球标记的荧光免疫印迹检测方法

说明书

本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种量子点纳米球荧光免疫印迹检测痕量蛋白的方法。本发明首先将待测蛋白混合物凝胶电泳分离，电泳分离后的凝胶转移至固相载体膜上，然后将负载蛋白的固相膜封闭，加入待测蛋白的特异性一抗反应后，洗涤，再与量子点纳米球标记的荧光二抗反应，洗涤，最后蛋白印迹膜在激发光照射下，显影拍照。本发明方法提供的荧光免疫印迹检测蛋白的方法，与化学发光相比，具有无需发光底物、检测信号更稳定可长期保存、结果的一致性和可重复性等特点；与近红外荧光免疫印迹相比，具有无需额外的信号放大步骤、荧光信号更稳定、无需避光操作、无需昂贵的近红外激光扫描仪检测等特点。

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种用量子点纳米球标记的荧光免疫印迹检测痕量蛋白的方法。

背景技术

蛋白免疫印迹(Western Blot)是将电泳分离后的细胞或组织裂解物从凝胶转移到固相膜(常用硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯膜)，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，是目前生物实验室常用的蛋白分析检测方法。

目前实验室常用的免疫印迹显色方法包括：酶促底物化学发光和近红外荧光法，化学发光法一般采用辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗加化学发光底物(ECL)显影，化学发光信号需要采用胶片曝光、定影等复杂操作步骤，或者化学发光成像设备进行曝光成像。近红外荧光法采用近红外染料标记的二抗与膜上的一抗反应后，然后采用激光近红外荧光扫描成像，克服了传统荧光二抗检测灵敏度较低的缺点，也克服了化学发光法操作步骤复杂、需要发光底物、容易过度曝光等缺点，但激光近红外荧光扫描成像仪价格昂贵限制了其在实验室的广泛应用，同时近红外荧光染料易于光漂白，实验需要全程避光操作。

量子点(quantum dot，简称QDs)作为一种新型荧光纳米晶，具有一些独特的荧光性能，如荧光发射波长可控、发射峰狭窄对称、激发波长范围广、量子效率高、光稳定性好等，量子点的上述荧光特性为制备高灵敏度的免疫荧光探针提供了很好的选择。2005年Ornberg等报道了量子点荧光技术在Western Blot分析中的应用(R.L Ornberg,T.F.Harper,H.Liu,Nature Methods,2005,2,79-81)，量子点Western Blot技术具有灵敏、可定量、多元检测等特点。同年，Bakalova等报道了利用生物素-亲和素信号放大的超灵敏Western Blot技术(R.Bakalova,Z.Zhelev,H.Ohba,Y.Baba,J.Am.Chem.Soc.,2005,127,9328–9329)，与传统的量子点标记物比较，生物素-亲和素放大后的量子点Western Blot检测灵敏度提高5倍，但上述生物素-亲和素方法需要额外的孵育步骤，实验步骤也更复杂。胥传来等利用生物素-亲和素的特异性结合反应(W.Chen,D.Xu,C.Xu et al.,Anal.Chem.,2009,81,9194–9198)，将量子点团聚制备得到亲和素化的多聚量子点，然后与膜上的生物素化一抗结合，其对蛋白的检测线性范围为30-1500pg；然而生物素-亲和素制备的多聚量子点步骤较复杂且保质期较短，且需要生物素化的一抗，因而在Western Blot的应用中受限制较多。

尽管目前关于量子点在Western Blot检测中的应用有较多的报道，但量子点免疫荧光探针在对非常微量的蛋白进行检测时，还存在信号低，噪音干扰大等问题(J.Lei,H.Ju,Chem.Soc.Rev.2012,41,2122-2134)。因此对目前的量子点免疫荧光探针制备方法进行改进，提高检测的灵敏度、稳定性和易操作性是目前分析检测领域迫切的需求。且目前关于量子点在Western Blot检测中的应用也较少与实验室常用的化学发光显色方法进行平行比较。

发明内容

本发明的目的是建立以量子点纳米球为标记物的荧光免疫印迹(Western Blot)蛋白检测方法，利用量子点纳米球为免疫标记物，提供一种高灵敏、多色、方便、快捷的Western Blot显色技术。