[发明专利]一种量子点纳米球标记的荧光免疫印迹检测方法

权利要求书

1.一种用量子点纳米球标记的荧光免疫印迹检测蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：首先将待测蛋白混合物进行凝胶电泳分离，电泳后的凝胶进行western blot电转移至硝酸纤维素膜（NC膜）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，然后对蛋白转移后的膜进行封闭，加目标蛋白特异性的一抗孵育反应，再加入一抗种属特异性的二抗标记的量子点纳米球进行孵育反应，最后将膜在激发光源照射下成像拍照。

2.根据权利要求1所述的量子点纳米球标记的免疫印迹检测蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

（一）量子点纳米球标记抗体的制备

（1）利用微乳液溶剂挥法制备量子点-聚合物复合纳米球；

A、油相组分：将量子点和聚合物分散在氯仿溶液中，量子点的浓度为0.1～5微摩尔每升，聚合物的浓度为0.05～5.0 mg/mL；

B、水相组分：将聚乙烯醇和十二烷基磺酸钠配置成水溶液，其中聚乙烯醇的浓度为0.01～2.5%，十二烷基磺酸钠的浓度为0.1～0.5%；

C、4℃水浴中，磁力搅拌下，将油相溶液加入水相溶液中，持续搅拌10～60分钟，然后使用超声破碎仪将混合液进行超声处理1～10分钟，即得到均匀稳定的微乳液；

D、室温下，将微乳液置于敞口容器，磁力搅拌下，使溶剂逐渐挥发，挥发时间为6～48小时，离心洗涤，干燥得到量子点纳米球；

（2）将二抗共价偶联在量子点纳米球表面

A、量子点纳米球分散在pH 4.0～6.0的磷酸盐缓冲液中，纳米球浓度0.5～5mg/mL，然后加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）和N-羟基硫代琥珀酸亚胺（sulfo-NHS），浓度0.1～1.0 mmol/L，二者摩尔比为1/1，室温下孵育30分钟；

B、向活化后的纳米球溶液中加入抗体，抗体的浓度为50～500 µg/mL，然后室温下孵育1小时后，加入牛血清白蛋白，浓度为1～10 mg/mL，继续室温下孵育2h；

C、得到的反应产物，在5000～20000转每分的转速下，离心0.5～2小时，弃去离心上清后，将沉淀分散在磷酸盐缓冲液中，即得到量子点纳米球免疫荧光二抗；

（二）免疫印迹分析目标蛋白

（1）SDS聚丙烯酸按凝胶（SDS-PAGE）电泳

根据待测目标蛋白的分子量选择合适浓度的分离胶和浓缩胶，混合蛋白上样后，在恒压条件下进行电泳；

（2）Western blot转移蛋白

分离后的蛋白电泳凝胶去除浓缩胶部分，平铺在经过浸泡处理的NC膜或者PVDF膜上，按3层滤纸、凝胶、NC膜或PVDF膜、3层滤纸叠放，置于半干式电转仪上，恒流转膜；

（3）免疫检测

将转好的膜用TBST缓冲液清洗后，置于封闭液中孵育封闭，之后用目标蛋白特异性的一抗孵育，然后TBST洗涤两次，加入1:500-5000稀释的量子点纳米球球标记二抗，室温孵育0.5-2 h，再用TBST洗涤3次；

洗涤后的膜在紫外光源照射下，即得到荧光免疫印迹图像。