[发明专利]一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌

权利要求书

1.一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因；所述表达载体为pBIG2-ura5s-ITs；所述表达宿主为高山被孢霉。

2.如权利要求1所述的一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，其特征在于，所述苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)ATCC#32222。

3.如权利要求1或2所述的一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，其特征在于，编码所述苯丙氨酸羟化酶(PAH)的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

4.如权利要求1-3任一所述的一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，其特征在于，所述表达宿主为高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株CCFM501；所述高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株CCFM501已于2013年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCC No.8414。

5.如权利要求1-4任一所述的一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，其特征在于，所述重组质粒通过农杆菌介导转化进入表达宿主。

6.如权利要求5所述的一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，其特征在于，所述农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。

7.如权利要求5或6所述的一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，其特征在于，所述农杆菌介导转化为先将重组质粒转化入农杆菌后，再用含重组质粒的农杆菌转化表达宿主。

8.如权利要求7所述的一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，其特征在于，所述含重组质粒的农杆菌需培养为孢子后再转化表达宿主；所述培养为将含有重组质粒的农杆菌在含有利福平和卡那霉素的YEP固体培养基平板上培养，挑取培养得到的单克隆菌落接种至含有利福平和卡那霉素的液体YEP培养基中再进行培养，将得到的培养液离心收集菌体，倒掉上清，加入IM培养基重悬菌体后再离心收集菌体，倒掉上清，加入IM培养基重悬菌体并调整菌浓度后进行培养，将培养得到的农杆菌培养液与高山被孢霉孢子液按照一定的比例混合，涂布于铺有玻璃纸的IM固体培养基进行培养，将玻璃纸转移到含有壮观霉素和头孢噻肟抗生素的SC固体培养基上进行培养持续观察菌落在SC固体培养基表面上的生长情况，若长出明显菌落，及时将菌落外沿挖出，继续接种于SC固体培养基上进行培养，待SC固体培养基表面上的菌落长出后，再挑取菌丝转接于SC固体培养基以排除阴性转化子，重复此操作多次后，将生长的菌落接种至GY固体培养基培养至产生大量优化后的含有重组质粒的农杆菌孢子。