[发明专利]扩增子测序文库及其构建方法

说明书

扩增子测序文库及其构建方法，本发明提出测序接头，所述测序接头包括依次相连的基底结合序列、测序引物序列、内识别序列以及扩增引物序列。利用本发明的测序接头构建扩增子测序文库，能够实现一步PCR扩增，并且扩增效率高，数据准确性强、利用率高、拆分均一度高，操作简便，适于规模化应用。

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及扩增子测序文库及其构建方法。更具体地，本发明涉及测序接头、试剂盒、扩增子测序文库的构建方法、测序方法及扩增子测序文库。

背景技术

第二代测序技术，又称新一代测序技术，是相对于以Sanger测序法为代表的第一代测序技术而得名。Illumina作为二代高通量测序的主流技术，其文库构建原理是在未知的DNA 序列两侧加上固定序列的接头，通过不同oligo的结合对未知序列进行操作，最终完成测序。接头的结构决定了测序的质量和下机数据的格式。

在测序前构建文库的过程就是在测序目的序列两侧加上特定序列，大多数文库的构建方式是通过连接反应，但是在扩增子测序文库中使用的是PCR扩增，结构如图1所示(单Index)，其中，P5和P7区域决定了文库和芯片基底上对应的接头连接，Rd1SP和Rd2SP 区域决定了测序时结合的测序引物。

然而，目前适用于扩增子测序文库的接头及构建方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

Illumina公司公开了一种Nextera建库方法，即利用具有双端index的接头通过两轮PCR 构建扩增子文库。具体过程如下(流程参见图2)：

第一步：通过自己合成的第一轮引物1和引物2将环境中感兴趣的基因片段通过PCR 富集出来。

第一轮 引物1

TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG(SEQ ID NO：44)

第一轮 引物2

GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC (SEQ ID NO：45)

第二步：再通过以下试剂盒将PCR产物两侧加成完整长度的最终序列(第二轮PCR)。

Nextera XT Index Kit(Illumina公司提供的一款试剂盒)

第二轮引物1：

5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]TCGTCGGCAGCGTC(SEQ ID NO： 46)

第二轮引物2：

5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTCTCGTGGGCTCGG(SEQ ID NO：47)

TCGTCGGCAGCGTC为第一轮引物1和第二轮引物1的重叠部分

GTCTCGTGGGCTCGG为第一轮引物2与第二轮引物2的重叠部分。

经过两轮PCR最终得到了完成的文库序列结构如图3所示，其中NNNNN…是PCR 产物的待测序目的片段序列。

接头1：