[发明专利]一种制备、分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法

权利要求书

1.一种制备、分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1）培养黑曲霉：黑曲霉种子液按照6-8%的接种量含有发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养温度为30-34℃，罐压为0.02-0.03MPa，风量为500-600L/h，培养时间为30-40h；

步骤2）制备发酵液：将干酪乳杆菌种子液按照8-10%的接种量接入到发酵罐中，再添加甲醇，继续培养20-30h，通过流加氨水控制pH为7.2-7.8，得到发酵液；所述甲醇的添加量为0.1-0.2wt%；

步骤3）制备粗酶液：以5000rpm离心5min，收集菌体沉淀，将菌体沉淀研磨粉碎，再添加五倍重量的0.1mol/L的磷酸缓冲液浸提，4℃浸提，完成后4℃、12000rpm离心20min，取上清液，即为粗酶液；

步骤4）分离纯化：取粗酶液，过DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，收集洗脱液，然后过Superdex-200 凝胶过滤层析柱，洗脱，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得即得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心的转速为2000rpm，时间为5min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浸提时间为2h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉种子液的制备方法为：将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，然后接种到种子培养基进行培养，获得密度为（1-2）×10⁸CFU/mL的黑曲霉种子液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述斜面培养基组分为：马铃薯150g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子培养基的组分均为：蔗糖20g/L，酵母膏10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.02g/L，一水硫酸锰0.01g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干酪乳杆菌种子液的制备方法为：将干酪乳杆菌接入到MRS琼脂培养基中进行培养，然后接种到MRS液体培养基中进行种子培养，获得密度为（3-5）×10⁸CFU/mL的干酪乳杆菌种子液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析柱为DEAE-Sepharose离子交换层析柱，所述凝胶过滤层析柱为Superdex-200 凝胶过滤层析柱。