[发明专利]阿克拉霉素类似物及其制法和用途

权利要求书

1.一种式I化合物的制备方法，

其中，所述的R₁和R₂各自独立地选自下组：H、

其中，表示连接位点；

所述方法包括步骤：

(1)提供一种加利链霉菌Streptomyces galilaeus MA144-M1突变菌株，其特征在于，所述的菌种中阿克拉霉素生物合成基因簇中的酮基合酶基因aknB和链延伸因子基因aknC被失活敲除，具体如下：由aknB和aknC左臂正向引物SEQ ID NO:7和左臂反向引物SEQ IDNO:8以及aknB和aknC右臂正向引物SEQ ID NO:9和右臂反向引物SEQ ID NO:10克隆得到用于aknB和aknC基因敲除的左臂和右臂片段，连接入载体得到缺失质粒，然后导入Streptomyces galilaeus MA144-M1中进行同源重组后得到重组菌株sHY075001；

(2)用式Ⅱa化合物对经改造的aknB和aknC敲除突变株进行饲喂，然后从培养物中提取式Ⅰ化合物，离心弃去上清，丙酮浸泡菌体和HP20吸附树脂，过滤除去不溶物，滤液经减压蒸馏抽干，获得的膏状物先用200-300目硅胶预装的正相柱进行粗分，再用HPLC制备进一步纯化，得到所述的式I化合物；

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的化合物选自下组：

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤(a)：

(a)用加利链霉菌突变菌株进行发酵，并对发酵产物进行分离，得到所述的突变蒽环骨架IIa；其中，所述的加利链霉菌突变菌株中，阿克拉霉素生物合成基因簇中负责第一个糖基上载的糖基转移酶基因aknS和aknT被失活或敲除，且所述的菌株中还包括异源表达的越野他汀生物合成基因簇中的基因kstA10和kstA11；

所述的aknS和aknT采用左臂和右臂片段进行基因敲除，且所述的左臂片段以Streptomyces galilaeus MA144-M1的总DNA为模板，采用如下所示的正向引物：

5’-ATATCTAGACATGCACCACGAATGGGTCAC-3’；和如下所示的反向引物：

5’-ATACATATGCTCCTCGACGAGCCCTCGTT-3’

进行扩增得到；

所述的右臂片段以Streptomyces galilaeus MA144-M1的总DNA为模板，采用如下所示的正向引物：

5’-ATACATATGGAGATGACGGCCCAGTTCGCT-3’；和如下所示的反向引物：

5’-ATAAAGCTTGTGCGCTCCTCACTCGTCGA-3’

进行扩增得到；

所述kstA10和kstA11异源表达片段以Micromonospora sp.TP-A0468的总DNA为模板，用如下的正向引物：

5’-ATACATATGTCTAGAACCGGGACTGGCCGGACTAC-3’；和如下的反向引物：

5’-ATAGAATTCATAATAACTAGTCCTCGGCGCTGCCGTATGCC-3’

进行扩增得到。