[发明专利]耐热性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用

说明书

本发明提供了耐热性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用，本发明采用定向进化技术对来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶进行蛋白质工程改造，具体使用易错PCR方法对葡萄糖氧化酶基因进行突变，再通过高通量筛选方法将正突变检出，得到热稳定性提高的突变体，相比野生型葡萄糖氧化酶GOD‑1，本发明得到的5个突变体GOD‑T‑1、GOD‑T‑2、GOD‑T‑3、GOD‑T‑4、GOD‑T‑5热稳定性得到了显著的提高，在70°C处理3min后，残余酶活分别提高了1.2、1.9、2.9、2.2和1.5倍。本发明提供的葡萄糖氧化酶突变体具有良好的市场应用前景和工业价值。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及耐热性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,E.C.1.1.3.4,GOD)以分子氧为电子受体，能专一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶目前应用比较广泛，GOD是葡萄糖检测传感器的重要工具酶，在生物医学和食品加工领域应用较多。GOD作为食品添加剂，能够抑菌、延长商品货架期、防止食物褐变。GOD如果在工业上大规模应用必须具备较高的酶活水平和较高的酶稳定性。目前工业应用大部分来源于真菌的GOD，考虑到生产成本和应用成本，GOD必须能够在较高的温度条件下和更长的时间内保持稳定，如在面包焙烤的高温条件下、饲料造粒的高温条件下均能保持良好的稳定性。GOD的优化可以利用现代分子技术与生物工艺工程技术相结合，实现经济可行的酶生产系统，将基因工程技术和蛋白质工程技术相结合，提高GOD稳定性以进一步提升其工业价值。

定向进化技术属于蛋白质的非理性设计范畴，其不需要了解蛋白质三维空间结构，在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择)，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能的基因序列。定向进化在体外模拟了突变、重组和选择的自然进化机制，是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。易错PCR(epPCR)是无性进化的一种，利用PCR过程中出现的碱基错配，对特定的基因进行随机诱变的技术。

发明内容

本发明提供了耐热性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用，本发明提供的葡萄糖氧化酶突变体热稳定性比野生型葡萄糖氧化酶有了显著的提升。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了耐热性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD-T-1，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-T-1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的突变体GOD-T-1由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第112位的缬氨酸变为异亮氨酸获得。

本发明提供了耐热性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD-T-2，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-T-2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述的突变体GOD-T-2由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第39位氨基酸由苏氨酸变为赖氨酸、第112位的缬氨酸变为异亮氨酸获得。

本发明提供了耐热性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD-T-3，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-T-3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的突变体GOD-T-3由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第93位氨基酸由苏氨酸变为脯氨酸、第112位氨基酸由缬氨酸变为异亮氨酸获得。

本发明提供了耐热性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD-T-4，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-T-4的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述的突变体GOD-T-4由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第112位的缬氨酸变为异亮氨酸、第211位氨基酸由甘氨酸变为天冬氨酸、第512位的酪氨酸变为色氨酸获得。