[发明专利]一种B型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种B型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，其中，所述慢病毒载体还包括FIX基因。本申请改造后的慢病毒载体的基础上特异地连入FIX基因，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递，使得FIX基因在骨髓相关细胞中的表达量明显增加，能够更高效的完成B型血友病基因治疗过程中正常基因的传递。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种B型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，尤其涉及一种应用改良后的慢病毒载体优化表达FIX基因用于制备治疗B型血友病的药物。

背景技术

B型血友病(Hemophilia B)是一种由于机体FIX基因突变造成的FIX缺失或功能不全引起的机体凝血功能障碍的出血性疾病。B型血友病患者的血浆中FIX活性低于正常水平的40％，并且根据血浆中该因子的活性将疾病分为三种类型：严重(<1％)，中度(1％-5％)，轻度(5％-50％)。该病患者活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患者没有明显外伤也可发生“自发性”出血。新生男性婴儿中血友病B型的发生率为1:25,000，并无种族和地域特异性。

目前主要是依靠补充功能正常的FIX蛋白来进行替代治疗(Replacementtherapy)，主要使用人血中提取或重组纯化的FIX蛋白。然而该蛋白的来源血液制剂存在人免疫缺陷病毒(HIV)及肝炎病毒等病原污染的可能，虽然随着基因工程方法应用于因子的合成及纯化，感染传染病的风险被大大降低，但是病人持续性的替代治疗医疗费用十分高昂，并且需要终生治疗，生活质量低下。事实上，只要患者血浆中凝血因子活性少量增加(≥正常水平的2％)就可以显著改善病症，这使得基因治疗方法成为根治该病的一种可能，为B型血友病患者带来全新的希望。

CN 101351229公开了一种装载FIX基因的猴免疫缺陷病毒(SIV)载体治疗剂，用该治疗剂感染脐带血干细胞之后将细胞移植入NOD/SCID小鼠体内，观察到了超过60天的FIX持续性表达。也有较多医用腺病毒相关病毒(Adeno associated virus，AAV)载体携带肝脏特异性启动的FIX蛋白进行小鼠的基因治疗，结果显示小鼠体内能够有一定量的FIX蛋白表达，并能够达到治疗剂量，但是并不能实现该基因长期有效的在体内进行表达。此外AAV载体免疫原性较高，人类接触AAV并对其产生抗体反应的概率很高，在很大的程度上限制了AAV在基因治疗领域的应用。

因此，如何选用一种免疫原性更低，并且能够实现长期有效的基因表达的载体，并且其基因传递效率高的同时又能具有良好的安全性能是实现B型血友病基因治疗的重要保障。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种B型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述B型血友病慢病毒载体转染效率更高，稳定性更强，安全性更好。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体为在pTYF慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，具体改造方式如下：

(a)其5’端的剪接供体位点被删除或改造，改造后的慢病毒载体剪接供体位点不是所述包装载体和所述参照慢病毒之间的同源重组的潜在位点；

(b)其仍具有病毒包装信号功能；

其中，所述慢病毒载体还包括FIX基因。