[发明专利]一种快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物及其应用

说明书

本发明公开一种快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物及其应用，属于动物细菌学及分子生物学技术领域。所述PCR扩增引物由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物组成；上述引物用于制备检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增试剂盒。该试剂盒提供的PCR检测方法具有高度的特异性和敏感性，重复性好，可信度高，快速准确的获得检测结果，同时价格低廉、操作简便，解决了传统鉴别方法分离率低，耗时费力等不足，适合基层使用，可作为溶血性曼氏杆菌实验室快速检测和大规模流行病学调查的一种快速、准确、简便的检测工具。

技术领域

本发明涉及动物细菌学及分子生物学技术领域，具体涉及一种快速、简便、低成本检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物及其应用。

背景技术

溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica ）属于巴氏杆菌科，为革兰阴性的球杆菌，是存在于牛、绵羊、山羊等反刍动物以及其他多种动物上呼吸道的常在菌和机会致病菌。在某些诱发因素作用下，溶血性曼氏杆菌可导致上述动物引发致死性肺炎。病毒和支原体的感染使得机体溶血性曼氏杆菌更易感，如副流感病毒及绵羊肺炎支原体等。此外，环境骤变、运输等造成的机体应激以及动物整体健康状况降低均可以使这两种细菌引发呼吸道疾病或影响疾病的严重程度。目前，溶血性曼氏杆菌在全球范围内均有分布，给养牛业、养羊业造成了重大的经济损失。在临床上，溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌不仅可以单独感染，两者也可以继发感染或混合感染，且引起的呼吸道症状相似，这为采取针对性的防治措施带来困难。

常规的鉴别溶血性曼氏杆菌的方法是病原分离鉴定，即通过对细菌的表型特征和生化指标进行鉴定，但该鉴定方法存在费时费力等缺点。此外，由于溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌在形态大小、染色特性等方面极为相似，为准确鉴别这两种细菌的造成困难，并且经常无法准确鉴别这两种细菌。因此，建立一种可以快速、准确检测和鉴定溶血性曼氏杆菌的方法在实验室检测和流行病学调查方面具有重要的应用价值。

发明内容

本发明目的是提供低成本、快速、准确地检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物及其应用。为实现本发明目的，使用如下的技术方案：

本发明提供一种快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物，是依据溶血性曼氏杆菌gcp基因进行设计，扩增的目的片段大小为220 bp，所述PCR扩增引物引物的序列分别为：

Forward primer：5ˊ- GGGCAATACGAACTACTCGG -3ˊ SEQ ID NO:1

Reverse primer：5ˊ- TCGTATTCGCAGCAAAGGTT -3ˊ SEQ ID NO:2

使用前将引物浓度稀释至25 pmol/μL。

优选的，将所述PCR 扩增引物在制备检测溶血性曼氏杆菌试剂盒的应用。

本发明还提供一种快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增试剂盒，所述PCR扩增试剂盒包括具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物。

优选的，，所述PCR扩增试剂盒还包括PCR预混液和RNase-Free water；所述的PCR预混液由PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA组成，利用快速检测溶血性曼氏杆菌的PCR扩增试剂盒建立PCR扩增方法，其反应体系建立以25 μL计，其中

PCR 预混液 12.5 μL

Forward primer（25 pmol/μL） 1μL

Reverse primer（25 pmol/μL） 1μL