[发明专利]检测油菜产品转基因成分的四重荧光PCR引物探针组、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了检测油菜产品转基因成分所用的四重荧光PCR引物探针组，包括针对ACCg8、CruA、PE3‑PEPcase、Bxn的四重引物探针组A，CaMV35S、FMV35S、NPT II、NOS的四重引物探针组B，Bar、PAT、EPSPS、GOX的四重引物探针组C，具体如Seq.ID No.1至Seq.ID No.36所示。本发明属于基因工程检测技术领域，检测所用的引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点，可以实现对油菜产品尤其是菜籽油转基因成分的准确检测。

技术领域

本发明属于基因工程检测技术领域，尤其涉及检测油菜产品转基因成分的四重荧光PCR引物探针组、试剂盒及方法。

背景技术

目前，转基因作物的品种和产量正在迅速增长：欧盟基本禁止了转基因作物的种植，但进口、加工、销售较多，如玉米、油菜、大豆、甜菜均在市场流通和食用；美国大量种植、生产和销售大豆、玉米、棉花等多种转基因作物。我国农业部批准发放了7种转基因作物安全证书，分别是耐储存番茄、抗虫棉花、改变花色矮牵牛、抗病辣椒、抗病番木瓜、转植酸酶玉米、抗虫水稻，每种转基因作物均包含若干具体获证品系，并允许种植、生产、加工、销售。

油菜(Brassica napus L.)在我国无商品化转基因品系种植。2004年起，我国农业部给予安全证书(进口)的有Monsanto的GT73(RT73)和Bayer的MS1×RF1、MS1×RF2、MS8×RF3、T45(HCN28)、Oxy-235、Topas19-2(HCN92)共7个品系，其中T45(HCN28)、Topas19-2(HCN92)为抗草铵膦性状，Oxy-235为抗溴苯腈性状。据相关报道，从2013年起，每年有上百万吨转基因菜籽油进口我国，多来源于加拿大。在加拿大，油菜种植中80％左右为转基因品系，而转基因品系中95％以上为抗除草剂品系，按种植比例依次为Monsanto公司GT73(RT73)抗草甘膦品系约46％、Bayer公司MS8×RF3抗草铵膦品系约31％、Pioneer Hi-bred公司NS抗咪唑啉酮系列约15％。由于转基因油菜在种植上优势明显，因而转基因菜籽油相对国内非转基因菜籽油在市场价格上便宜20％以上。

我国《食品安全法》规定，生产经营转基因食品应当按照规定显著标示，由消费者自由选择。目前，PCR技术是检测和鉴定转基因产品的主流方法，通过对样品提取DNA以检测某外源基因，从而判定样品是否含有该转基因成分。

油菜产品包括油菜植株、油菜籽粕和菜籽油。油菜植株和油菜籽粕含有大量细胞组织，按照常规方法可通过自动化的核酸提取仪或商品化的提取试剂盒获取DNA，不再冗述。目前油菜产品的DNA提取重点和难点在于菜籽油DNA提取。菜籽油主要成分为油脂，DNA残留量极低，如果按照核酸提取仪或提取试剂盒通常为1mL的取样量进行提取，几乎无法获取到能达到检出限的DNA量；如果将取样量放大到L级，又会因为无法适用核酸提取仪或提取试剂盒的运行规范而导致难于操作。目前，各检测单位通常采用增大取样量，用自制试剂进行手动提取的方法来获取DNA，这些方法种类广泛、区别很大，导致操作较复杂，检测结果的重复性较差，不利于规范化操作。

油菜相关产品的DNA检测，目前以PCR技术为主要技术手段。第一代PCR技术，通常称为普通PCR技术，先设计物种特异基因的引物，再将样品DNA和引物及扩增试剂混匀后通过PCR仪对目的基因进行反复扩增，然后通过电泳对扩增产物进行鉴定，从而判定是否含有该物种源性成分。

第二代PCR技术为实时定量荧光PCR，通常简称荧光PCR。除了设计物种特异基因的引物外，再设计一条荧光探针。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光PCR仪(通常简称荧光PCR仪)对目的基因进行反复扩增，探针的荧光信号累积与基因扩增同步，相对普通PCR，既提升了扩增时的特异性，扩增结束后也立即获得检测结果。