[发明专利]实时荧光PCR真菌检测引物、探针、试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及一种实时荧光PCR真菌检测引物、探针、试剂盒及检测方法，其实时荧光PCR真菌检测引物，所述引物包括：上游引物ITSF1和下游引物ITSR1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1‑2所示。本发明的实时荧光PCR真菌检测试剂盒具有能实现三类真菌的区分检测及念珠菌的种鉴定的优点。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术，特别涉及一种实时荧光PCR真菌检测引物、探针、试剂盒及检测方法

背景技术

近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂、抗恶性肿瘤药物的广泛应用，以及器官移植、各种侵入性诊疗技术的深入开展，致病真菌感染日益增多。致病真菌主要包括念珠菌、曲霉菌、隐球菌、接合菌等。研究认为，念珠菌、曲霉菌、肺孢子菌和隐球菌是最主要的致病真菌感染病原菌，其中念珠菌居首。全世界每年约1.4million患者因为这四种致病真菌感染死亡，而真菌病中，90％致死率的真菌为隐球菌、念珠菌、曲霉菌和肺孢子菌。据统计数据显示，2014年共收集3310株致病真菌菌株，91.4％为念珠菌、隐球菌6.3％、毛孢子菌1.0％、其他菌属1.3％。其中念珠菌中白念念珠菌占比41.4％、热带念珠菌占比15％、近平滑念珠菌占比16.9％、光滑念珠菌9.3％、季也蒙念珠菌2.6％、克柔念珠菌1.3％。

目前，致病真菌感染的流行病学特征已发生改变，白色念珠菌曾是念珠菌感染的主要菌种类型，然而研究认为，近年来光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等其他念珠菌的感染率也在逐渐上升；北美及欧洲的许多中心调查显示，以往不常见的真菌，如隐球菌属、镰刀菌属等，现在其发病率也有所提高，尤其隐球菌属发病率仅次于念珠菌属和曲霉菌属。

然而，目前对致病真菌的检测主要还是依赖传统的检测方法，包括培养法、显微镜检查、酶联免疫、血清培养、免疫学等，但是这些方法一般耗时长、敏感性差，而且容易出现假阳性或假阴性结果。再者，培养过程中真菌会在感染部位迅速增殖，等到培养结果出来之前可能就会发生很严重的后果，容易延误病情的诊断与及时预防治疗。另外，大多数学者利用真菌通用引物ITS4和ITS86检测rRNA基因的ITSII序列，可以将致病真菌鉴定到属，但该方法需要借助于测序来鉴定真菌的种类，耗时较长，不利于致病真菌感染的早期诊断。鲁卫平等采用构建通用引物的一次PCR法，并结合纳米金新型基因芯片检测系统，实现了一次对多个临床常见致病酵母菌的检测分析，但是生物芯片技术存在着成本高、复杂、灵敏度低、重复性差等缺点，限制了生物芯片的广泛应用。近年来，质谱技术以其快速准确的优点被用于微生物鉴定，由于质谱鉴定必须是培养后分纯的单克隆菌落，而且设备昂贵，操作难度高等限制了其应用。

实时荧光PCR技术作为一种新兴的检测手段，具有敏感性好、重复性好、避免PCR污染、检测时间短、自动化程度高、线性范围宽等优点，逐渐被应用到病原性真菌检测中。郭强等采用实时荧光定量PCR，建立了快速鉴定白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌的方法，以真菌通用引物ITS4、ITS86为检测引物，最低检测下限达到1-5CFU/mL，可同时检测5种念珠菌。鲁巧云等采用基于TaqMan水解探针的实时荧光定量PCR的方法，建立了真菌通用检测体系、念珠菌检测体系、曲霉检测体系，以血清为标本可将临床常见的曲霉和念珠菌鉴定到属的水平。韩学贞等采用荧光定量PCR染料结合法检测致病真菌，建立的检测体系可检测念珠菌属、曲霉菌属、新型隐球菌。